张丹丹，孙玉婵，路迎冬，方旭琴，曲 艺，崔向宁

心血管疾病是目前全球最主要的死亡原因，动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是其病理基础[1-3]。动脉粥样硬化被广泛认为是由动脉壁内含有脂质的巨噬细胞沉积驱动所致的与炎症反应有关的慢性进行性疾病[4-5]，且动脉粥样硬化的进展也会伴随着不断升级的血管壁炎症。大量的临床试验研究充分表明，对于冠心病病人通过降低血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平，可以降低20%～30%心血管事件风险，在极高危病人中甚至可达40%～50%[6]。但临床研究结果同时显示，尽管动脉粥样硬化病人在接受充分的他汀类药物治疗的部分病人中，即使LDL-C水平已经达标，但心血管事件仍有发生，炎症仍可能成为剩余心血管事件发生的主要驱动因素[7]。核转录因子-κB(nuclear factor kappa，NF-κB)信号通路通过介导多种细胞因子的表达参与动脉粥样硬化的发生和发展[8-11]，已成为抗动脉粥样硬化药物研究的靶点之一[12-13]。冠心舒通胶囊临床广泛用于冠心病的预防和治疗[14-16]，本课题组前期实验研究发现，冠心舒通胶囊能够降低ApoE基因敲除(ApoE-/-)小鼠的血脂水平，缩小动脉粥样硬化斑块面积。本实验进一步研究冠心舒通胶囊对ApoE-/-小鼠主动脉及血清炎性因子和NF-κB表达的影响，探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 16只6～8周龄雄性C57BL/6小鼠，48只6～8周龄雄性同系ApoE-/-小鼠，全部由北京大学医学部(实验动物科学部)提供，无特定病原体(SPF)级，体质量18～20 g，许可证号：SCXK(京)2011-0012，饲养于中国中医科学院广安门医院实验动物中心动物房，动物室为清洁级，动物的饲养条件：温度(20±2)℃，湿度(50±2)%，标准12 h光照/12 h黑暗节律，自由饮水。C57BL/6小鼠采用标准饲料喂养，ApoE-/-小鼠采用高脂饲料(76.5%标准饲料、0.5%胆酸钠、5%白糖、3%胆固醇、10%猪油、5%蛋黄粉配制)喂养，饲料由北京科澳协力饲料有限公司提供。

1.2 药物 冠心舒通胶囊为胶囊制剂(由广枣、丹参、丁香、冰片、天竺黄组成)，由陕西步长制药有限公司生产，批准文号：Z20020055。阿托伐他汀钙片，由Pfizer Ireland Pharmaceuticals生产，批准文号：国药准字J20120050。

1.3 试剂和仪器 白细胞介素-6(IL-6)试剂盒和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)试剂盒均由北京华英生物技术研究所提供，一抗小鼠抗大鼠NF-κB p65单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology，批号：sc-8008)，二抗PV-6000(北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：17G57D08)，TNF-α(Abcam，批号：Ab66579，兔多克隆抗体)，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体(Santa Cruz Biotechnology，批号：SC-365062)，免疫组化棕色 DAB显色试剂盒(北京中杉生物技术有限公司)，3K18小型台式冷冻离心机(德国Sigma公司)，脱水机(武汉俊杰电子有限公司 JT-12S)，包埋机(武汉俊杰电子有限公司 JB-P7)，病理切片机(德国Leica公司 RM2235)，CX21显微镜(日本奥林巴斯)，图像分析软件：Image-Pro Plus Version 6.0(IPP，USA)型图像分析软件。

1.4 方法

1.4.1 模型制备及分组 16只6～8周龄雄性C57BL/6小鼠普通饮食饲养作为正常对照组；48只6～8周龄雄性同系ApoE-/-小鼠，采用高脂饲料喂养至12周(随机杀死小鼠3只，油红O染色，脂质斑块形成，造模成功)建立动脉粥样硬化模型，将造模成功小鼠随机分为模型组、冠心舒通组、阿托伐他汀组，每组15只。

1.4.2 给药方式及途径 冠心舒通组按照0.41 g/(kg·d)冠心舒通胶囊灌胃，阿托伐他汀组按照5 mg/(kg·d)阿托伐他汀钙片灌胃，模型组和正常对照组灌胃等体积生理盐水，每日1次，连续灌胃8周。

1.4.3 样品制备 小鼠饲养至20周，禁食12 h，摘眼球取血，血液离心后-80 ℃冻存，进行血清学检测；无菌条件下解剖小鼠，切取小鼠主动脉，仔细剥除结缔组织，用生理盐水冲洗干净后，主动脉组织一部分常规4%多聚甲醛固定，石蜡包埋用于组织学分析；另一部分新鲜组织离体后液氮冷冻，用于蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测。

1.4.4 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清IL-6、TNF-α水平 每组选取8只小鼠，摘眼球取血离心，取血清，测IL-6、TNF-α水平，实验步骤按照产品说明书操作。

1.4.5 免疫组织化学法检测主动脉组织中NF-κB p65蛋白的表达水平 将备用切片预热后脱蜡、梯度乙醇脱水。自来水冲洗2 min，pH 6.0柠檬酸盐缓冲液高压、140 ℃修复2.5 min，自然冷却。自来水冲洗3次，3%过氧化氢(H2O2)孵育10 min，灭活内源性过氧化物酶。pH 7.2磷酸盐缓冲液(PBST)冲洗3次，每次2 min，滴加一抗NF-κB p65(Santa Cruz Biotechnology，sc-8008，1∶500，鼠单克隆抗体)，37 ℃孵育2 h。pH 7.2 PBST冲洗3次，每次2 min，滴加一步法试剂盒中的二抗即PV6000中的羊抗鼠试剂，室温孵育20 min。pH 7.2 PBST冲洗3次，每次2 min，DAB显色自来水冲洗，75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇逐级脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件进行分析，每组选取3只小鼠，在200倍光镜下随机选取5个不重叠视野拍照，计算每张图片阳性染色区域的积分光密度值(IOD)。

1.4.6 Western Blot检测主动脉组织中TNF-α蛋白的表达水平 取适量主动脉组织，用干净眼科剪剪成碎块，用PBST洗涤2次，加入细胞裂解液，低温机器匀浆混匀，移入离心管中1 000 r/min，低温离心10 min，

取上清用BCA法行蛋白定量后制成蛋白样品。取上样，经SDS-PAGE电泳，取出电泳后的胶浸入转膜液平衡120 min，行湿转法蛋白转膜，5%血清白蛋白(BSA)-PBST室温封闭1 h。TNF-α一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育40 min。经洗涤、显影、灰度扫描后，用Scion Corporation分析软件对电泳条带进行测定，分别以目的条带灰度与内参条带GAPDH灰度的比值表示TNF-α蛋白表达水平。

2 结 果

2.1 实验动物存活情况 采用高脂喂养ApoE-/-小鼠12周，造模成功后小鼠行动缓慢，毛发稀疏无光泽。正常对照组小鼠活动进食正常，毛发顺滑，浓密有光泽。

2.2 各组血清IL-6、TNF-α水平比较 与正常对照组比较，模型组小鼠IL-6、TNF-α水平升高，差异均有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，冠心舒通组和阿托伐他汀组IL-6、TNF-α水平均下降，差异均有统计学意义(P<0.01)，冠心舒通组和阿托伐他汀组比较差异无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 各组小鼠血清IL-6、TNF-α水平比较(±s) 单位：pg/mL

2.3 各组主动脉组织中NF-κB p65蛋白表达水平比较 4组小鼠主动脉组织中NF-κB p65存在不同程度表达，与正常对照组相比，模型组主动脉组织中NF-κB p65蛋白的表达水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组相比，冠心舒通组和阿托伐他汀组主动脉组织中NF-κB p65蛋白的表达水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.01)。详见图1、图2。

图1 各组NF-κB p65蛋白表达的免疫组织化学检测结果(阳性表达为棕色颗粒)

与正常对照组比较，＊ P<0.01；与模型组比较，# P<0.01。

2.4 各组主动脉组织中TNF-α蛋白表达水平比较 为进一步量化TNF-α的表达情况，进行Western Blot检测。结果显示：与正常对照组相比，模型组TNF-α蛋白表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，冠心舒通组和阿托伐他汀组TNF-α蛋白表达水平均下降，差异均有统计学意义(P<0.01)。详见图3。

与正常对照组比较，＊ P<0.01；与模型组比较，# P<0.01。

3 讨 论

近年来，研究人员从动脉粥样硬化发生过程中的不同病理变化入手阐述其机制，曾先后提出脂质浸润学说、氧化应激学说、平滑肌细胞克隆学说、炎症反应学说等多种机制，越来越多的研究表明，非感染性以及感染性因素引起的炎症机制贯穿于动脉粥样硬化的始终[17-18]。NF-κB是具有多向转录调节作用的核蛋白因子，经高糖、低氧等刺激活化后参与调控多种细胞因子的生成， 在正常生理条件下，NF-κB位于细胞质中，其p65亚基以同型二聚体的形式与抑制性蛋白IκB单体结合，形成复合体处于无活性状态。当受到外界各种病理因素的刺激时，蛋白激酶B(Akt)作为其重要的上游分子，可通过磷酸化IκB激酶促使后者降解IκB，使NF-κB与IκB分离，NF-κB激活并移位进入细胞核，与特异靶基因结合，启动基因转录及蛋白表达，诱导产生多种促炎症细胞因子[19-20]。目前研究证实NF-κB参与调控的细胞因子IL-6和TNF-α与动脉粥样硬化炎症、内皮细胞损伤、平滑肌细胞增殖等过程，以及动脉粥样硬化的发生发展密切相关。

IL-6由巨噬细胞分泌，是参与心血管疾病的重要的炎性因子。激活的IL-6可直接损伤血管内膜，导致炎症介质分泌增多，引起血管壁的炎症反应，增加动脉粥样硬化斑块面积。有学者提出，病人血清中IL-6浓度越高，其发生冠状动脉硬化及再发心绞痛的风险越大[21]。IL-6还可刺激基质降解酶的合成，侵蚀斑块内的基质，从而导致不稳定斑块破裂。IL-6在动脉粥样硬化斑块形成和发展中起着重要作用，可以作为动脉粥样硬化等其他心血管疾病重要的预测因子。TNF-α是一种多功能的炎性细胞因子，主要由激活的单核细胞、淋巴细胞分泌。TNF-α作为NF-κB的主要下游因子，是炎症反应中最早的启动因子和损伤内皮细胞的主要因素[22]。研究证实在心肌梗死后处于稳定期的男性病人中， TNF-α升高与复发性冠状动脉事件的危险性增加有关[23]。有研究表明在正常动脉组织中没有TNF-α的表达，在动脉粥样硬化斑块中存在TNF-α的表达，此外大量的TNF-α可使动脉粥样硬化斑块向不稳定性方向转变[24-25]。因此，检测IL-6、TNF-α表达水平可作为预测心脑血管事件的指标，降低其表达水平有利于延缓或抑制动脉粥样硬化进程。

动脉粥样硬化的形成多为喜食肥甘，脾胃受损，运化失司，聚湿成痰，痰湿郁结，蒸腾津液，侵入心脉，络损血瘀，而致痰瘀互结损伤脉管，影响局部气血温煦功能，结块日久越坚，这种痰瘀凝块即是冠状动脉硬化之斑块。冠心舒通胶囊由广枣、丹参、丁香、天竺黄、冰片组成，其中广枣行气活血，为君药，丹参养血活血、祛瘀止痛，为臣药，丁香、冰片温中降逆、调畅气机，为佐药，天竺黄清热豁痰为使药，全方共奏活血祛瘀、化痰通络、行气止痛之功效，体现了痰瘀同治的思想。现代药理研究证实广枣果皮中含有丰富的有机酸类成分，其具有抗炎症反应的作用[26]。丹参中主要成分丹参酮ⅡA可作用于NF-κB信号通路的多个作用环节，包括抑制NF-κB-DNA复合体的形成、NF-κB结合活性及IκBα的磷酸化，从而实现对受NF-κB调控的下游促炎因子的调节，有效减低体内炎症因子及抑制甚至阻断炎症表达通路来达到缓解体内炎症反应[27-28]。本研究表明，冠心舒通胶囊可显著降低动脉粥样硬化小鼠血清炎性因子IL-6和TNF-α水平，并能降低小鼠动脉粥样硬化斑块中TNF-α和NF-κB的表达，推断其抗动脉粥样硬化的作用机制与阻断NF-κB信号传导通路的过度激活、抑制炎症细胞在动脉管壁集聚有关。