陈 靖， 郑 琦， 陈 薇， 赖瑞敏， 朱月永

（福建医科大学第一附属医院肝病中心，福建医科大学肝病研究所，福建福州350005）

肝纤维化（hepatic fibrosis，HF）是肝脏受到各种致病因素（包括病毒、酒精、代谢及免疫等）持续刺激，引起细胞外基质（extracellular matrix，ECM）弥漫性过度沉积的一种“创伤愈合”修复过程。HF 是各种慢性肝病进展为肝硬化甚至肝癌的关键步骤，也是影响预后的重要环节。HF 的形成机制复杂，除了针对某些肝病的病因治疗以外，迄今仍无有效或公认的抗HF 治疗方法用于临床。研究显示，HF 及少部分肝硬化加以干预后从组织学上是可逆转的［1］。

肌成纤维细胞（myofibroblast，MFB）是各种慢性肝损伤过程中产生ECM 的主要细胞，目前肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）仍是各种临床和实验性 HF 模型中 MFB 的主要来源［2］。HSCs 活化后转化为具有纤维性和明显收缩性的MFB，并分泌大量趋化因子和细胞因子，这一病理生理变化被认为是HF发生与发展的中心环节［3］。细胞自噬是一种细胞自我吞噬的程序性死亡，在许多纤维化疾病及肿瘤的病理过程中起着关键作用。异常的自噬活动会导致HF 的发生，其主要途径是促进HSCs 的活化和增殖［4］，但目前尚不清楚HSCs 自噬是如何被触发的。微小RNA（microRNAs）是一类内源性非编码RNA，具有调控靶基因表达的功能，参与生命过程中一系列重要进程（如细胞分化、增殖、死亡等）［5］。表达异常的microRNAs 可以通过RNA 干扰途径影响自噬水平，使microRNAs成为近年来自噬研究的新动向［6］。

microRNAs 对HF 的发病过程也起着重要的调节作用，若干microRNAs 可调控参与HF 形成的细胞因子，或通过调控HSCs 的活化、增殖和凋亡等，促进或减缓HF进程［7-8］。我们前期研究显示，慢性乙型肝炎患者血清与肝组织中microRNA-181a 表达水平随HF程度加重而逐渐增高，高峰出现在III期HF（肝硬化前期）患者中［9］。因此，本研究通过四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）建立大鼠 HF 模型，并在体外诱导自噬以及在细胞水平进行干预实验，探讨microRNA-181a 是否通过调控自噬而活化HSCs，以期为早期评估HF 提供潜在的生物标志物，并为以microRNA-181a为靶点的抗纤维化治疗提供参考资料。

材 料 和 方 法

1 动物和细胞

SPF 级雄性 Wistar 大 鼠 40 只，8 周龄，体重（200±10）g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号为SCXK（沪）2017-0005。大鼠肝星状细胞系HSC-T6（ATCC细胞库，货号Y-01626）。

2 主要试剂

CCl4、转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）、MTT 和DTT（Sigma）；逆转录试剂盒和SYBR Premix EX Taq 试剂盒（TaKaRa）；兔抗鼠β-actin 单克隆抗体（Santa Cruz）；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔II 抗和羊抗鼠 II 抗及TGF-β1 ELISA 试剂盒（北京中杉金桥公司）；PVDF 膜（Millipore）；Protein Molecular Weight Marker 和 Trizol 试剂盒（Thermo）；蛋白定量检测试剂盒和 Protease Inhibitor Cocktail（Life）；RPMI-1640 培养基、Lipofectamine 3000（Invitrogen）；LC3-I、LC3-II、beclin-1 和 α-平滑肌肌动蛋白（αsmooth muscle actin，α-SMA）单克隆抗体（Abcam）；I型胶原（collagen type I，Col I）及Ⅲ型胶原（collagen type Ⅲ，Col Ⅲ）单克隆抗体（Santa Cruz）；其他生化试剂均为国产分析纯。microRNA-181a inhibitor（microRNA-181a-i）和 inhibitor negative control（NC-i）由中国上海吉凯公司提供；microRNA-181a 和U6 引物的设计与合成由中国上海博尚公司完成，见表1。

3 主要方法

3.1 动物分组及HF 模型制备 以单纯CCl4法诱导大鼠 HF 模型［10］。40 只大鼠适应性喂养 1 周后，随机分为空白对照（control）组和 CCl4诱导 HF 模型 2 周（W2）、4 周（W4）、6 周（W6）及 8 周（W8）组，每组 8只。control 组皮下注射3 mL/kg 的橄榄油；W2、W4、W6 及 W8 组皮下注射 3 mL/kg 的 40%CCl4（4∶6 混合橄榄油），每周2 次，分别连续作用2、4、6 及8 周；各组于饲养周期末处死存活大鼠，经腹主动脉取血，分离血清后-70℃冰箱保存；取肝左叶相同部位组织，经4%多聚甲醛固定送病理及免疫组化检查，另取肝右叶相同部位组织，液氮冷冻后-70℃冰箱保存。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.Sequences of the primers for RT-qPCR

3.2 肝组织Masson 染色及纤维化评估 大鼠肝组织石蜡包埋后常规脱蜡至水，加Masson 复合液5 min，流水洗2～5 min，加0.2%醋酸处理1 min×2，流水洗1 min，加1%磷钨酸5～10 min，流水洗1 min，加亮绿染色液复染15 min，流水洗2～3 min，0.2%醋酸处理1 min×2，流水洗1～2 min，常规脱水透明，中性树胶封片，镜下观察：肝细胞胞浆呈红色，胶原呈蓝绿色。取Masson 染色切片，每个切片随机取5 个视野（物镜×10），以蓝色胶原沉积为阳性信号，用Image-Pro Plus 5.0 图像分析软件计算胶原容积分数（collagen volume fraction，CVF）。

3.3 ELISA 检测血清及肝组织中TGF-β1 水平 根据ELISA 试剂盒说明书检测大鼠血清及肝组织中TGF-β1含量。

3.4 RT-qPCR 检测血清及肝组织中microRNA-181a的表达 参照Trizol 试剂盒说明书提取大鼠血清及肝组织总RNA，按照说明书逆转录合成cDNA；参照SYBR Premix EX Taq 试剂盒操作说明进行qPCR，总反应体积为20 μL，扩增参数为：95℃ 5 min；95℃15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s。以 U6 为内参照，以 2-ΔΔCt法计算microRNA-181a的相对表达水平。

3.5 Western blot 法检测肝组织 LC3-II/-I、beclin-1、α-SMA、Col I 和Col III 蛋白表达 取大鼠肝组织加组织裂解液进行匀浆，加等体积2× SDS，充分振摇15 s，沸水浴中加热 10 min，4℃、12 000×g离心 10 min，取上清液，10% SDS-PAGE 分离 2～3 h，半干式转膜 1 h，将 PVDF 膜置于含 3%BSA 的 TBST 中，室温放置30 min；按说明书加抗LC3-II、LC3-I、beclin-1、α-SMA、Col I 和Col III 抗体，4℃孵育过夜，次日用TBST洗膜5 min×3 次，加相应的II 抗（1∶5 000），37℃孵育1.5 h，TBST 洗膜5 min×3 次，曝光，凝胶成像分析系统分析。以β-actin为内参照，以目的蛋白吸光度（A）值/β-actinA值表示目的蛋白水平。

3.6 不同浓度TGF-β1 诱导HSC-T6 细胞自噬 以TGF-β1诱导HSC-T6细胞自噬［11］。HSC-T6细胞接种于 6 孔培养板（2×104cells/well），第 2 天更换无血清RPMI-1640 培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h，予TGF-β1 梯度处理，终浓度依次为0、1、2、5 和10 μg/L，每个浓度设5 个复孔，继续孵育24 h 后收集细胞，进行后续检测。

3.7 细胞分组及培养 HSC-T6 细胞接种于6 孔培养板（2 ×104cells/well），至细胞达40%～60%汇合度时分为5 组：（1）control 组，采用正常细胞培养；（2）microRNA-181a-i组及NC-i组，按脂质体转染试剂Lipofectamine 3000 操作说明书并参考文献［12］，分别转染浓度为 50 nmol/L 的 microRNA-181a-i 和 NC-i 4 h；（3）TGF-β1组，更换无血清RPMI-1640培养液；（4）3-MA 组，参考文献［13］加浓度为 10 mmol/L 的 3-MA 孵育45 min。除control组外，其余各组均加TGF-β1（根据3.6 筛选的最佳浓度）继续孵育24 h。每组设5 个复孔，同步收集细胞进行后续检测。

3.8 RT-qPCR 检 测 HSC-T6 细 胞 microRNA-181a 表达 参照Trizol 试剂盒说明书提取HSC-T6 细胞总RNA，其他步骤参见血清及肝组织RT-qPCR检测法。

3.9 Western blot 法检测 HSC-T6 细胞 LC3-II/-I、beclin-1、α-SMA、Col I 和 Col Ⅲ蛋白表达 HSC-T6 细胞干预完成后，弃细胞培养基，加TBS（2 mL/well）漂洗1 次，将6 孔培养板于滤纸上轻拍2～3 次后置于冰板上，加入热裂解缓冲液1× SDS（300 μL/well），细胞刷刮动数次，将细胞裂解液移至1.5 mL 的EP 管，沸水浴中加热10 min，12 000×g离心10 min，取上清液至新的EP 管，-70℃保存待测。其他步骤参见肝组织Western blot法检测。

4 统计学处理

采用SPSS 17.0 软件进行统计分析。数据均以均数±标准差（mean±SD）表示。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD 法；两变量间相关分析采用Spearman 相关分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1 CCl4诱导建立大鼠HF模型

Masson染色显示，control组肝小叶结构规则，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状规则排列，组织间隙中未见到蓝绿色组织；W2 组肝小叶结构较规则，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状较规则排列，组织间隙中可见少量蓝绿色组织；W4 和W6 组肝小叶结构不规则，肝细胞于中央静脉周围不呈放射状排列，组织间隙中可见中等量蓝绿色组织；W8 组肝小叶结构紊乱，组织间隙中可见大量蓝绿色组织，见图1A。肝组织胶原分析结果显示，CCl4可呈时间依赖性促进肝组织胶原沉积，与control 组相比，W2 组肝组织CVF 显著增加（P＜0.05），W4、W6 和W 8 组肝组织CVF进一步增加（P＜0.01），见图1B。

Figure 1.Liver pathological changes induced by CCl4 for 2～8 weeks in rats.Masson staining method was used to show the collagen fibrils in liver tissue（scale bar=25 μm），and the volume fraction of collagen was analyzed.a：control group；b：W2 group；c：W4 group；d：W6 group；e：W8 group.Mean±SD. n=8. *P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.图1 CCl4诱导的大鼠肝脏组织病理学改变

2 CCl4对大鼠血清及肝组织TGF-β1水平的影响

ELISA 结果显示，CCl4呈时间依赖性地促进大鼠血清及肝组织中TGF-β1 含量增加。与control 组相比，W2 组大鼠血清及肝组织中TGF-β1 水平均显著增加（P＜0.05）；W4、W6 和W8 组进一步增加（P＜0.01），见表2。

表2 CCl4对大鼠血清及肝组织中TGF-β1水平的影响Table 2.The effects of CCl4 on the protein levels of TGF-β1 in serum and liver tissue of rats（Mean±SD. n=8）

3 CCl4对大鼠肝组织中microRNA-181a 表达水平及 LC3-II/-I、beclin-1、α-SMA、Col I 和Col Ⅲ蛋白水平的影响

RT-qPCR 与 Western blot 结果显示，CCl4呈时间依赖性地上调大鼠肝组织microRNA-181a 表达水平以及LC3-II/-I 比值、beclin-1、α-SMA、Col I 和Col III 蛋白水平。与control组相比，W2组肝脏组织中microRNA-181a 表达水平及LC3-II/-I 比值、beclin-1、α-SMA、Col I 和Col III 水平均显著增加（P＜0.05）；W8 组 microRNA-181a 表达水平较W6 组下降，但并无显著差异；W8 组 LC3-II/-I 比值及 beclin-1 水平较 W6 组显著下降（P＜0.01），见图2。大鼠肝组织microRNA-181a表达水平与 LC3-II/-I 比值、beclin-1、α-SMA、Col I 和Col Ⅲ水平呈显著正相关（P＜0.01），r值分别为0.748、0.539、0.724、0.829及0.836。

4 不同浓度TGF-β1 对HSC-T6 细胞自噬及microRNA-181a表达水平的影响

Western blot 与RT-qPCR 检测结果分别显示：TGF-β1 呈浓度依赖性地促进HSC-T6 细胞自噬相关蛋白LC3-II/-I 比值、beclin-1 水平以及microRNA-181a 表达水平上调；与 TGF-β1 0 μg/L 处理组相比，TGF-β1 1、2、5 和 10 μg/L 处理组LC3-II/-I 比值和beclin-1水平以及microRNA-181a表达水平均显著增加（P＜0.05）；与 TGF-β1 5 μg/L 处理组相比，TGF-β1 10 μg/L 处理组 LC3-II/-I 比值和 beclin-1（P＜0.05）水平显著下降，但microRNA-181a 表达水平并无显著性差异，见图3。因此，本研究以5 μg/L 为TGF-β1诱导HSC-T6细胞自噬的最佳浓度进行后续实验。

Figure 2.The effects of CCl4 on the expression of microRNA-181a，LC3-II/-I，beclin-1，α-SMA，Col I and Col III in rat liver tissue.A：RT-qPCR was used to measure the microRNA-181a level；B：Western blot was used to measure the expression levels of LC3-II/-I，beclin-1，α-SMA，Col I and Col III.Mean±SD. n=8. *P＜0.05 vs control group；▲▲P＜0.01 vs W6 group.图2 CCl4对大鼠肝脏组织中microRNA-181a表达水平及LC3-II/-I、beclin-1、α-SMA、Col I和Col Ⅲ蛋白水平的影响

5 microRNA-181a-i 对 TGF-β1 诱导 HSC-T6 细胞自噬和microRNA-181a表达水平的影响

RT-qPCR 检测结果显示，与control 组相比，TGF-β1 组和 NC-i 组 HSC-T6 细胞 microRNA-181a 表达水平均显著升高（P＜0.01），microRNA-181a-i 组microRNA-181a 水平较 NC-i 组显著下降（P＜0.01），NC-i 组和 3-MA 组较 TGF-β1 组并无显著差异，见图4A。Western blot 检测结果显示，与control 组相比，TGF-β1组和NC-i组HSC-T6细胞LC3-II/-I比值和beclin-1水平均显著升高（P＜0.01），NC-i组LC3-II/-I比值和beclin-1 水平较TGF-β1 组并无显著差异，microRNA-181a-i 组 LC3-II/-I 比值和 beclin-1 水平均较NC-i 组显著下降（P＜0.01），microRNA-181a-i 组LC3-II/-I 比值较 3-MA 组显著下降（P＜0.05），但 beclin-1水平并无显著差异，见图4B。

6 microRNA-181a-i 对 TGF-β1 诱导 HSC-T6 细胞活化的影响

Western blot 检测结果显示，与control 组相比，TGF-β1 组和 NC-i 组 HSC-T6 细胞 α-SMA、Col I 及 ColⅢ水平均显著升高（P＜0.01），但 TGF-β1 组与 NC-i组间均无显著差异；与NC-i组相比，microRNA-181a-i组及 3-MA 组 HSC-T6 细胞 α-SMA、Col I 及 Col Ⅲ水平均显著下降（P＜0.01），但microRNA-181a-i 组与3-MA组间并无显著差异，见图5。

Figure 3.The effects of different concentrations of TGF-β1 on the expression of LC3-II/-I，beclin-1 and microRNA-181a in HSC-T6 cells detected by Western blot and RT-qPCR.Mean±SD. n=5. *P＜0.05 vs 0 μg/L group；#P＜0.05 vs 5 μg/L group.图3 不同浓度 TGF-β1 对HSC-T6 细胞LC3-II/-I 和 beclin-1蛋白水平及microRNA-181a表达水平的影响

Figure 4.The effect of microRNA-181a-i on the expression of LC3-II/-I，beclin-1 and microRNA-181a in HSC-T6 cells treated with TGF-β1（5 μg/L）.A：RT-qPCR was used to measure microRNA-181a expression；B：Western blot was used to measure the protein levels of LC3-II/-I and beclin-1.Mean±SD. n=5.**P＜0.01 vs control group；△△P＜0.01 vs NC-i group；☆P＜0.05 vs microRNA-181a-i group.图4 microRNA-181a-i对TGF-β1诱导HSC-T6细胞自噬和microRNA-181a表达水平的影响

Figure 5.The effects of microRNA-181a-i on activation of HSC-T6 cells treated with TGF-β1（5 μg/L）.Western blot was used to measure the protein levels of α-SMA，Col I and Col Ⅲ.Mean±SD. n=5.##P＜0.01 vs control group；**P＜0.01 vs NC-i group.图5 microRNA-181a-i对TGF-β1诱导HSC-T6细胞活化的影响

讨 论

HF 的形成是一个多因素影响、多细胞因子参与的极为复杂的病理生理过程，个体化差异也较大，临床针对病因治疗并不能完全抑制肝脏炎症和治疗HF。近年来研究表明，碧萝芷通过下调ERK 磷酸化介导的细胞自噬，可抑制TGF-β1 诱导的HSCs 活化［14］。在CCl4和胆管结扎诱导小鼠HF 模型的研究中表明，槲皮素［15］与红景天甙［16］可通过抑制TGF-β1/Smads 信号通路，抑制HSCs 自噬及活化，减轻小鼠HF。然而，在以抑制HSCs 活化为中心的抗HF 治疗方面，除了经典的致HF 信号转导途径外，包括自噬和表观遗传在内新的机制与通路的研究并不多。

本研究通过皮下注射CCl4构建大鼠HF 模型，病理组织学检查结果显示模型组大鼠肝组织均出现不同程度HF，并与造模时间呈正相关，提示大鼠HF 模型成功复制。此外，模型组大鼠肝组织TGF-β1 和microRNA-181a 的表达水平、自噬标志性蛋白LC3-II/-I 的比值及beclin-1 的水平均随HF 程度加重而呈上升趋势，且microRNA-181a 表达水平与细胞自噬呈正相关，提示在HF启动及进展过程中，TGF-β1和microRNA-181a 表达与肝细胞自噬之间可能存在某种病理、生理上相关联的机制，值得进一步探讨。

目前普遍认为，TGF-β 是强效的致纤维化细胞因子，在纤维化的启动和进展中起关键作用［17］。人体内 TGF-β1 为 TGF-β 超家族主要成员，可在肝脏炎症前期、炎症及炎症后阶段通过“三步级联反应”刺激HSCs活化并转化成MFB［18］，后者能大量合成ECM并逐渐沉积，启动HF 进程。在此进程中涉及多条信号通路并相互影响。以往研究显示，TGF-β/Smads信号转导为 TGF-β1 刺激 HSCs 活化的主要通路［19］。近年来有研究显示，HSCs 活化依赖于自噬活性，活化的HSCs 大量增殖并产生大量胶原纤维时，也需要通过自噬降解过程来提供能量［20］。另有报道，TGF-β通过不同途径参与了肝癌细胞、乳腺癌细胞、肾小球基底膜细胞及成骨细胞等的自噬调控［21］。然而，TGF-β1 是否基于自噬促进HSCs 活化少有报道。本研究体外实验显示，TGF-β1 呈浓度依赖性地促进HSC-T6 自噬标志性蛋白LC3-II/-I 比值及beclin-1 水平增高，α-SMA、Col I和Col Ⅲ蛋白水平也显著增高，提示TGF-β1 能体外诱导HSCs 自噬及活化，这一结果与王冰莹等［22］报道结论较为一致。本研究显示，TGF-β1 体外诱导 HSCs 自噬最佳浓度为 5 μg/L，当TGF-β1 浓度增加至 10 μg/L 时 HSCs 自噬相对下降，提示TGF-β1 仅在一定浓度范围诱导HSCs 自噬，这与 Fu 等［11］报道的现象较为一致，但 TGF-β1 体外诱导HSCs 自噬的最佳浓度有差异，推测这可能与本研究以LC3-II/-I 比值而非LC3-II 抗体表达水平作为评估细胞自噬强弱有关。此外，本研究显示，在CCl4诱导大鼠严重HF 时TGF-β1 表达进一步升高，但细胞自噬有所减少，而高峰出现在严重HF 前期，提示在肝脏炎症前期与炎症期针对细胞自噬的调控可能为防治HF进展的合适时间窗。

研究显示，HSC-T6 细胞经 TGF-β1 处理后 microRNA-181a 表达显著上调，进而诱导HSC-T6 细胞活化［12］。以往有报道显示，microRNA-181a能减弱饥饿和雷帕霉素在乳腺癌MCF-7细胞、人类肝癌Huh-7细胞及慢性髓原白血病K562 细胞中诱导的自噬［23］；还能调控NR8383 大鼠肺泡巨噬细胞自噬紊乱与促炎因子生成［24］。然而，不同类型细胞的自噬在肝损伤及HF 过程中扮演不同角色，microRNA-181a 是否通过调控HSC自噬进而诱导其活化尚未见报道。本研究显示，TGF-β1 体外诱导 HSC-T6 自噬及活化时伴有microRNA-181a 表达显著上调；在转染microRNA-181a-i 后 microRNA-181a 表达显著下降，HSC-T6自噬及活化显著受到抑制，这一现象与自噬抑制剂3-MA 作用结果相似。据此，我们推测microRNA-181a 为 TGF-β1 下游信号分子，介导了 HSCs 自噬及活化，这可能是TGF-β1 促进HSCs 活化在表观遗传的一种调控机制。

综上所述，随着CCl4诱导模型大鼠HF 的进展，大鼠肝组织中TGF-β1和microRNA-181a表达及自噬水平呈同步增高；下调HSC-T6 细胞microRNA-181a表达水平可抑制TGF-β1 诱导HSC-T6 细胞自噬与活化；大鼠 HF 与 microRNA-181a 调控 HSCs 自噬有关。本研究可能为基于microRNA-181a水平调控HSCs自噬和活化，以及抗HF靶点治疗提供实验基础。