谢海娟 龙文清 王毓兴 姜 媛 俞红女

结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是消化道常见的恶性肿瘤，在全球范围内，其病死率在恶性肿瘤中位居第2位，约15%～20%的患者初诊时已发生脏器的远处转移[1, 2]。目前，尽管CRC在临床治疗方面取得了显著的进步,如放疗、化疗、手术切除、生物靶向和免疫疗法的综合治疗方法,但是CRC患者的预后仍不理想,尤其是晚期的CRC由于较高的局部复发和远处转移，其5年总生存期(OS)率不到10%，因此进一步提高疗效仍面临着巨大挑战[3]。

肿瘤侵袭转移是肿瘤患者治疗失败的主要原因，也是肿瘤临床治疗和基础研究的重点、焦点[4]。侵袭是肿瘤向血管外以及邻近组织转移的起始阶段，也贯穿着癌症发展的全过程。基质金属蛋白酶(MMPs)是肿瘤转移过程中非常重要的调控分子，主要通过降解ECM和基膜发挥其生物学效应[5]。MMP-9是MMPs家族中的重要成员，已有报道证实在脑、前列腺、乳腺、结直肠癌等肿瘤患者中MMP-9的表达水平与其转移程度及预后密切相关[6～9]。已有报道指出，TNF、12-O-十四烷基酚-13-乙酸酯(TPA)等可激活细胞内多种信号通路诱导MMP-9的表达，其中转录因子如c-fos、核因子-κB(NF-κB)和激活蛋白-1(AP-1)等参与调控MMP-9的表达[10]。这些诱导因子中TPA是蛋白激酶C(PKC)的特异性激活剂，在诱导肿瘤细胞侵袭及转移过程中发挥着重要作用[11]。活性氧(ROS)作为信号分子，在肿瘤的发生、发展中发挥着重要作用[12]。已有研究表明，PKC的激活可诱导ROS的产生，并进一步激活AP-1和NF-κB信号通路[13, 14]。因此，探究MMP-9及其上游途径的调控机制，将是恶性肿瘤研究和治疗的重要方向。

本研究观察PKC诱导结直肠癌细胞的侵袭作用，探讨ROS/p38MAPK通路参与PKC/MMP-9表达及细胞侵袭的作用机制，为治疗结直肠癌侵袭转移提供多靶点理论依据。

材料与方法

1.材料：人结直肠癌SW480细胞株购自中国科学院上海细胞库，RPMI1640培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清购自美国Hyclone公司；TPA、GF109203X、NAC、SB203580购自美国Sigma公司；Bradford蛋白浓度检测试剂盒、ECL试剂盒购自北京索莱宝公司；anti-p38、anti-p-p38、anti-β-actin购自美国Abcam公司；anti-p65、anti-MMP-9、HRP标记IgG购自美国Santa Cruz公司；Transwell侵袭系统购自美国Costar公司。

2.细胞培养：利用含有10%FBS的RPMI1640完全培养基，在5%CO2的37℃培养箱中培养结直肠癌SW480细胞，当达到80%～90%融合度时进行细胞传代培养。

3. Western blot法：根据实验目的进行100nmol/L TPA处理，或预处理 PKC抑制剂GF109203X(1μmol/L)、ROS抑制剂NAC(50μmol/L)、p38抑制剂SB203580(20μmol/L)，1h后与100nmol/L TPA共孵育。用总蛋白提取液或核蛋白提取试剂盒提取蛋白，每孔以30μg蛋白上样，SDS-PAGE电泳进行分离蛋白，并PVDF膜转移，5%脱脂牛奶封闭2h，在4℃环境下孵育一抗过夜，TTBS洗膜，常温孵育二抗2h，再次洗膜，ECL试剂盒显影，利用图像分析仪观察蛋白表达水平。

4.活性氧检测：为了动态实时观察细胞内活性氧浓度的变化，利用激光共聚焦显微镜检测。细胞培养在100g/ml poly-L-lysine 涂层的共聚焦培养皿3h，HBSS缓冲液洗3次，2,7-dichlorofluorescin dictate (DCF-DA)荧光探针孵育1h。根据实验目的同时预处理各种抑制剂1h，洗涤3次，在488nm激发/530nm发射下，待荧光信号稳定后给与TPA处理，用光电倍增管收集530nm处发射的荧光，共聚焦显微镜(Nikon)动态检测分析活性氧的含量。

5.明胶酶谱法：使用无血清的培养基处理各组细胞，24h后收集细胞上清液，与非还原缓冲液混合制备上样品，在0.1%明胶的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，2.5%Triton X-100缓冲液洗涤30min，在37℃环境中以0.02% Brij，5mmol/L CaCl2，50mmol/L Tris-HCl(pH7.5)溶液孵育过夜。进行0.25%考马斯亮蓝染色以及脱色，在图像分析仪上拍照分析。

6.Transwell侵袭实验检测：各组细胞悬液加入到有基质胶的上室，下室以条件培养基共孵育24h。然后，用棉签将留在腔室上侧的细胞除去，腔室下侧的细胞用0.1%甲醇固定并用甲苯胺蓝溶液染色，利用光学显微镜检测腔室下侧的侵袭细胞。

结 果

1.TPA对结直肠癌SW480细胞MMP-9蛋白表达的影响：利用免疫电泳法观察PKC激动剂TPA100nmol/L处理不同时间时细胞内MMP-9蛋白表达的情况。与0h比较，TPA诱导MMP-9蛋白表达上调，即呈时间依赖性，表明结直肠癌细胞中PKC激活可诱导MMP-9的表达上调(P<0.01，图1)。

2.TPA对结直肠癌SW480细胞ROS生成的影响：为了研究TPA诱导细胞侵袭过程中对ROS的作用，利用激光共聚焦测定了细胞内ROS的变化。与对照组比较，TPA组细胞内ROS水平显著增加，差异有统计学意义(P<0.01)；与TPA组比较，预处理PKC抑制剂GF109203X或ROS抑制剂NAC后细胞内ROS水平明显降低，差异均有统计学意义(P<0.01，图2)。

图1 TPA对SW480细胞MMP-9蛋白表达的影响 与空白对照组比较，*P<0.01

3.ROS对结直肠癌SW480细胞p38MAPK通路的激活作用：为进一步观察TPA诱导MMP-9的分子通路，检测了TPA诱导下p38的磷酸化情况。100nmol/L TPA在不同时间处理可时间依赖性上调p-p38的表达，在0.5h时表达上调最为明显(P<0.01，图3A)；与TPA组比较，预处理PKC抑制剂GF109203X或ROS抑制剂NAC后p-p38表达明显下调(P<0.05，图3B)。

4.ROS/p38MAPK对结直肠癌SW480细胞NF-κB通路的影响：为了证实ROS/p38MAPK介导细胞侵袭的分子机制，利用PKC抑制剂/ROS抑制剂/p38抑制剂预处理，然后与TPA共孵育，Western blot法检测核内NF-κB亚基p65的表达情况。结果显示，与对照组比较，TPA明显上调核内p65蛋白的表达(P<0.01)；与TPA组比较，预处理PKC抑制剂、ROS抑制剂、p38抑制剂明显下调p65核内表达(P<0.01，图4)。

图2 TPA对结直肠癌SW480细胞ROS的作用 与对照组比较，*P<0.01；与TPA组比较，#P<0.01

图3 TPA对SW480细胞p38MAPK通路的激活作用 A. TPA对p38磷酸化的影响；B.各种抑制剂对TPA诱导p38磷酸化的影响；与对照组比较， *P<0.01；与TPA组比较，#P<0.05，##P<0.01

图4 ROS/p38通路对核转录因子NF-κB的影响 与对照组比较，*P<0.01；与TPA组比较，#P<0.01

5.ROS/p38MAPK对TPA诱导结直肠癌SW480细胞MMP-9表达的影响：利用各种抑制剂预处理，采用蛋白印迹法检测MMP-9蛋白表达情况，明胶酶谱法检测MMP-9的分泌情况。与对照组比较，TPA组MMP-9蛋白表达及分泌显著增加(P<0.01)；与TPA组比较，PKC抑制剂、ROS抑制剂、p38抑制剂组的MMP-9表达及分泌均显著降低(P<0.01，图5)。

6.ROS/p38MAPK对结直肠癌SW480细胞侵袭能力的影响：利用Transwell检测TPA诱导的细胞侵袭能力。TPA处理可诱导侵袭细胞数明显增加，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)；与PKC抑制剂、ROS抑制剂、P38抑制剂联合应用后，侵袭细胞数明显减少，且与单用TPA组比较差异有统计学意义(P<0.01，图6)。

图5 ROS/p38通路对MMP-9蛋白表达及分泌的影响 与对照组比较，*P<0.01；与TPA组比较，#P<0.01

图6 ROS/p38通路对细胞侵袭能力的影响(甲苯胺蓝，×200) A.空白对照组；B.TPA组；C.TPA+GF109203X组；D.TPA+NAC组；E.TPA+SB203580组； 与对照组比较，*P<0.01；与TPA组比较，#P<0.01

讨 论

近年来结直肠癌发生率呈逐年快速上升趋势，严重威胁我国人民的健康。结直肠癌早期临床症状不典型，导致部分患者在初诊时就已发生了肿瘤播散转移，病死率居高不下[15]。肿瘤侵袭在癌症转移中起着至关重要的作用，抑制肿瘤复发及转移是癌症治疗的重要目标。

MMP-9是肿瘤浸润和转移过程中的关键蛋白水解酶，可以通过降解肿瘤微环境中的基质，破坏生化机械屏障，以获得到细胞运动性，浸润周围组织、侵袭血管淋巴管实现肿瘤转移的启动[16]。有研究表明，在多种肿瘤组织中MMP-9蛋白表达明显上调，与患者的肿瘤侵袭、转移等不良事件密切相关，可作为评估肿瘤预后的风险因子，阻滞MMP-9表达及活性已成为预防和治疗肿瘤转移的研究焦点[17, 18]。因此，阐明MMPs在结直肠癌细胞内的激活途径和分子机制显得尤为重要。PKCs属于蛋白激酶家族，在肿瘤发生、发展及转移过程中起着重要作用[19]。笔者的研究表明，PKC特异性激活剂TPA可增加结直肠癌细胞MMP-9蛋白的表达及分泌，促进肿瘤细胞的侵袭过程，而这种促进作用可被PKC抑制剂GF109203X所抑制。这与相关研究中的TPA作为MMP-9的诱导剂参与多种信号通路激活的结论相符，也证实了在结直肠癌细胞中PKC激活可促进肿瘤侵袭转移[20]。

活性氧(ROS)是肿瘤发展的一个重要因素，可通过调控ROS的释放进一步介导肿瘤细胞的增殖、分化以及侵袭转移过程。在肿瘤细胞中，TPA诱导激活PKC可促进ROS的释放，同时ROS的增加可以进一步增强MAPK的活性，促进人肝癌细胞和乳腺癌细胞的迁移侵袭过程[21]。促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是细胞内主要信息传递因子，参与调控肿瘤细胞的增殖凋亡以及MMP-9的表达[22]。p38是MAPK家族中的重要成员，激活PKC可诱导p38磷酸化促进细胞的侵袭转移[23]。本研究结果显示，PKC抑制剂和ROS抑制剂可阻滞TPA诱导的细胞内ROS生成和p38的磷酸化，验证了TPA诱导结直肠癌细胞侵袭过程中激活ROS/p38MAPK信号通路。并且，PKC抑制剂、ROS抑制剂和p38抑制剂均阻滞了SW480细胞MMP-9的表达及侵袭能力，进一步说明了TPA通过ROS-p38MAPK通路诱导MMP-9表达和细胞侵袭。

NF-κB是调控MMP-9基因表达的重要核转录因子，细胞内多种信号通路级联参与了NF-κB的激活。在乳腺癌细胞中ROS、MAPK信号通路参与了NF-κB核转录因子的激活，进而调控MMP-9基因表达[24]。本研究结果显示，PKC抑制剂、ROS抑制剂、p38抑制剂均明显抑制TPA诱导的核内p65的表达增加，证实了ROS/p38参与PKC诱导结直肠癌细胞NF-κB信号通路的激活过程。

综上所述，TPA激活PKC诱导SW480细胞MMP-9表达及细胞侵袭，证实了ROS通过介导p38MAPK信号通路激活NF-κB，进而促进MMP-9表达及细胞侵袭能力的分子机制，为结直肠癌转移治疗提供了新的思路。