何 艳 布海切木·卡德尔 周晓珊 马彩玲 杨振华

骨质疏松症是一种全身性的骨代谢疾病，其特点是骨量减少、骨密度降低、骨组织微结构退化[1]。由于其患者在临床上发病缓慢且没有特定症状，因此被多数人忽视，特别是女性在绝经后因缺乏雌激素导致的骨质疏松[2]。然而，药物治疗有一定局限性[3]。因此，寻找有效的预防措施和治疗药物是非常必要的。

藏红花是一种中草药植物，可作为香料和食品着色剂使用，也可用于中医治疗和作为镇静剂、祛痰药和催吐药[4]。藏红花素是藏红花的一种成分[5]。藏红花素的药理作用已被证实，包括抗肿瘤、抗炎症、抗焦虑等方面[6～8]。近年来研究发现，藏红花素对骨疾病如骨肉瘤、关节软骨退变有保护作用[9]。但藏红花素对骨质疏松症的报道鲜少，且其具体的分子机制也不明确。本研究探讨了藏红花素对去卵巢骨质疏松小鼠和成骨细胞凋亡的影响及其分子机制，为临床治疗骨质疏松症提供可能的治疗靶点。

材料与方法

1.材料：40只8周龄SPF级雌性BALB/c小鼠(体质量21～24g)；藏红花素(美国Sigma-Aldrich公司)；雌激素(华北制药股份有限公司)；LY294002(PI3K/Akt信号通路抑制剂)和OC、ALP检测试剂盒(碧云天生物技术有限公司)；p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt抗体(美国CST公司)；β-actin抗体(上海相比生物公司)；DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、青霉素和链霉素(美国Sigma公司)；碱性磷酸酶(ALP)染色试剂盒(上海古朵生物科技有限公司)；Annexin Ⅴ-FITC细胞凋亡检测试剂盒(美国BD公司)。

2.骨质疏松模型建立及给药：小鼠随机分为4组(n=10)，包括假手术组、模型组、雌激素组和藏红花素组。参考Morris等[10]的研究，小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉，接受双侧开腹手术(假手术组)或双侧卵巢切除手术(模型组)。术后恢复4周，对造模成功的两组小鼠每天分别进行雌激素(25μg/kg)和藏红花素(20mg/kg)灌胃治疗，对假手术组和另一模型组进行等量蒸馏水灌胃，连续灌胃12周[11]。实验期间，每隔两周，对小鼠称重1次。

3.小鼠样本收集：在小鼠末次给药后，禁食24h，收集小鼠尿液，用2ml(1mol/L)的盐酸酸化。腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉，取眼球放血，1500×g离心10min提取血清。处死小鼠取左右腿股骨，浸泡在10%甲醛内，-20℃保存。

4.子宫指数：子宫指数=子宫质量(mg)/小鼠体质量(g)

5.骨密度检测：采用双能X线骨密度分析仪扫描和测量骨密度。测量结果以每平方厘米表面积的矿物含量克表示。

6.HE染色观察股骨组织病理学形态：将小鼠股骨脱钙处理1周，石蜡包埋和切片(5μm厚)。再依次进行二甲苯脱蜡、乙醇脱色、苏木精染色、分化、洗涤、伊红染色。最后在显微镜下观察。

7.骨代谢生化指标检测：利用全自动生化分析仪检测小鼠血清和尿液中Ca、P以及尿液中Cr含量，利用OC、ALP的ELISA试剂盒检测小鼠血清中OC、ALP水平。所有步骤均按照ELISA试剂盒说明书进行(n=3)。

8.Western blot法检测骨组织p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白表达：根据Schreiweis等[12]描述的方法提取骨蛋白。将裂解液离心、定量，经SDS-PAGE电泳，PVDF转膜，5%牛奶室温封闭1h，将PVDF膜孵育在p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、β-actin一抗孵育液中4℃过夜；再与相应二抗室温孵育1h，再用磷酸缓冲液(PBS)洗涤。最后用ECL显影。

9.小鼠成骨细胞的原代培养及鉴定：采用胰蛋白酶-胶原酶消化法和组织培养法提取原代成骨细胞。取小鼠胫骨并去骨膜，用PBS冲洗直到呈白色或透明。用眼剪将胫骨剪成约11mm的碎片。用0.25%胰酶消化变白，再于37℃、200r/min离心60min。离心得到白色沉淀，收集上清，用含10%FBS的低糖DMEM培养基培养在细胞瓶。每隔10min转移至新细胞瓶培养，重复两次，得到高纯度的成骨细胞悬液。选择第4代成骨细胞进行ALP染色鉴定及实验，ALP染色按试剂盒说明书进行。

10.成骨细胞分组与处理：将成骨细胞分为假手术组、模型组、藏红花素组、LY249002组、藏红花素+LY249002组。前两组可直接从小鼠提取，藏红花素组是在模型组中加4mmol/L藏红花素，LY249002组是在模型组细胞中加5μmol/L的LY249002，藏红花素+LY249002组是在模型组细胞中加了4mmol/L的藏红花素和5μmol/L的LY249002。

11.流式细胞术检测各组成骨细胞凋亡：将成骨细胞接种于6孔板中，细胞密度为2×105个细胞/孔，培养24h，收集细胞。用含5μl Annexin Ⅴ-FITC和5μl碘化丙啶(PI，1μg/ml)的300μl结合缓冲液重悬细胞，PBS洗两次，冰浴0.5h，再根据FACScan分析。

结 果

1.藏红花素改善模型小鼠体质量变化：在灌胃给药12周内，假手术组小鼠体质量增加缓慢，模型组小鼠体质量增长迅速(P=0.000)，与模型组比较，雌激素组和藏红花素组显著抑制了小鼠体质量的增加(P<0.01，图1)。

2.藏红花素升高模型小鼠子宫指数：与假手术组比较，模型组小鼠子宫指数降低(P<0.01)。与模型组比较，雌激素组和藏红花素组增加了小鼠子宫指数(P<0.01，图2)。

3.藏红花素改善模型小鼠骨组织病理形态：双能X线骨密度分析显示，与假手术组比较，模型组小鼠骨小梁密度显著降低，而与模型组比较，雌激素组和藏红花素组显著提高了骨小梁密度(图3A，P<0.05)。HE染色发现，假手术组骨小梁分布均匀，排列有序，骨小梁之间间隔小，模型组骨小梁分布稀疏，排列分散且有断点，与模型组比较，雌激素组和藏红花素组都改善了骨质疏松小鼠骨小梁分布与排列(图3B)。

4.藏红花素抑制模型小鼠尿液中U-Ca/Cr、U-P/Cr升高：生化分析显示，各组小鼠血清中S-Ca或S-P含量比较，差异无统计学意义(图4A、B)；与假手术组比较，模型组小鼠尿液中U-Ca/Cr和U-P/Cr水平升高，分别为104.5%和36.9%，与模型组比较，雌激素组和藏红花素组均能抑制U-Ca/Cr和U-P/Cr水平升高(P<0.05，图4C、D)。

5.藏红花素增加模型小鼠血清中OC、ALP水平：ELISA结果显示，与假手术组比较，模型组小鼠血清中OC、ALP水平升高，而与模型组比较，雌激素组和藏红花素组均显现出降低了OC、ALP水平(P<0.05，图5)。

图3 各组小鼠骨密度和骨形态变化 A.骨密度检测 ；B.HE染色(×200)；*P<0.05,**P<0.01

图4 各组小鼠血清和尿液中Ca、P、Cr水平 *P<0.05,**P<0.01,***P=0.000

图5 各组小鼠血清中OC、ALP水平 *P<0.05,**P<0.01

6.藏红花素调控PI3K/Akt信号通路：通过Western blot法检测骨组织中p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白表达。与假手术组比较，模型组小鼠骨组织中PI3K/Akt蛋白表达显著下调，与模型组比较，雌激素组和藏红花素组均上调PI3K/Akt蛋白表达(P<0.05,图6)。

图6 藏红花素调控PI3K/Akt信号通路 *P<0.05,**P<0.01,***P=0.000

7.藏红花素抑制成骨细胞凋亡：原代培养假手术组和模型组小鼠成骨细胞，经ALP染色鉴定为成骨细胞(P<0.01，图7A、B)。再经Western blot法检测p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt蛋白表达，发现蛋白表达在模型组中低于假手术组；藏红花素组多于模型组，LY249002组与模型组比较差异无统计学意义；而与藏红花素组比较，藏红花素+LY249002组蛋白表达被抑制，说明LY249002成功抑制了PI3K/Akt信号通路(P<0.05，图7C、D)。流式细胞术显示，与假手术组比较，模型组成骨细胞凋亡显著增多；与模型组比较，藏红花素组抑制了成骨细胞凋亡，LY249002组与模型组比较差异无统计学意义；但与藏红花素组比较，藏红花素+LY249002组抵消了藏红花素对成骨细胞凋亡的抑制作用(P=0.000，图7E、F)。

讨 论

骨质疏松症是一种以骨量减少和骨组织微结构退化为特征的骨代谢疾病，常见于绝经后女性，由于雌激素分泌不足导致她们对骨质疏松症的易感性明显增加[1]。研究发现，骨质疏松症抑制骨细胞分化和形成，降低骨质量和强度[11]。目前，骨质疏松症正成为主要公共卫生威胁。因此，探索治疗骨质疏松的有效药物至关重要。

藏红花是一种草本植物，具有很强的抗氧化性能[12]。藏红花素是藏红花颜色的主要化学成分，是西红花中一类主要药用成分，主要在治疗阿尔兹海默病、肿瘤、炎症等疾病有作用[4，6，7，13]。最新研究发现，藏红花素可减轻代谢综合征引起的大鼠骨质疏松症，但其分子机制未有报道[14]。笔者研究发现，藏红花素抑制去卵巢骨质疏松鼠体质量增加和骨密度降低，防止骨小梁微结构恶化。此外，还抑制了尿液中U-Ca/Cr、U-P/Cr和血清中OC、ALP水平的升高。OC和ALP都是骨代谢和骨形成的标志物，对成骨细胞凋亡有重要作用[15]。笔者还发现藏红花素抑制成骨细胞凋亡，而成骨细胞凋亡是导致骨质疏松的部分原因。因此，藏红花素可能通过抑制成骨细胞凋亡对去卵巢骨质疏松小鼠具有保护作用。

PI3K/Akt是参与调控细胞代谢、生长、增殖、死亡和存活的重要信号通路，也是干预多种疾病的前提[16]。此外，它还可影响骨形成和骨细胞存活，从而控制骨密度平衡[17]。笔者研究发现，PI3K/Akt信号通路在去卵巢骨质疏松小鼠中被抑制，而藏红花素可调控PI3K/Akt信号通路中关键分子表达。同时在成骨细胞中加入藏红花素抑制成骨细胞凋亡。而当在模型小鼠成骨细胞中加入藏红花素和LY249002时，藏红花素对成骨细胞凋亡的抑制作用则被抵消。因此，藏红花素可能通过调控PI3K/Akt信号通路来抑制骨质疏松小鼠成骨细胞凋亡。

综上所述，藏红花素可通过调控PI3K/Akt信号通路抑制成骨细胞凋亡，进而对去卵巢诱发的骨质疏松症具有保护作用。