罗孝全 唐 辉 冯 浩 陈 兵 孙 谋

脑胶质瘤在临床组织学和遗传学上都具有较高的异质性，例如低级别胶质瘤普遍存在异柠檬酸脱氢 酶1（isocitrate dehydrogenases 1，IDH1）突 变[1]。lncRNA MIR4435-2H 是一种新的致癌基因[2]。本文探讨lncRNA MIR4435-2HG的表达水平及甲基化状态与脑胶质瘤病理分级的关系。

1 资料与方法

1.1 标本来源 选取2019年1～12月手术切除的脑胶质瘤组织110例，其中男51例，女59例；中位年龄52岁；低级别胶质瘤（WHO分级Ⅰ～Ⅱ级）65例，高级别胶质瘤（WHO 分级Ⅲ～Ⅳ级）55 例；IDH1 突变46例。另外选取颅脑损伤内减压术中切除正常脑组织20 例为对照，其中男13 例，女7 例；中位年龄50 岁。本研究经我院医学伦理委员的批准。

1.2 实时荧光定量PCR 法检测MIR4435-2HG 表达术中获取组织标本迅速置于液氮中，24 h 后放到-80 ℃长期保存。另外，所有病人初诊时采集血液样本，留取血清，置于-80 ℃保存。使用QIAamp Min⁃Elute Virus Spin 试剂盒 和Qiamp DNA/RNA FFPE 组织试剂盒（德国Qiagen公司）分别提取血清和石蜡包埋组织快中RNA。使用SensiFASTTM cDNA 合成试剂盒（美国Bioline 公司）对2μg RNA 进行逆转录反应，获得cDNA。以1μg 稀释后cDNA 为模板，用SYBR Green Master Mix 试剂盒（美国Bio-Rad 公司）制备qPCR 反应混合物。以GAPDH 作为内源性对照。基于2-ΔΔCT方法，MIR4435-2HG表达被标准化为内源性控制GAPDH。

1.3 MIR4435-2HG 基因启动子甲基化检测 使用EpiTect bisulfite 试剂盒（德国Qiagen 公司）进行亚硫酸氢钠处理，并用Wizard DNA 纯化树脂（美国Pro⁃mega 公司）对修饰后的DNA 样品进行纯化。使用200 ng DNA 进行甲基化特异性PCR（methylationspecific PCR，MSP）扩增。分别用甲基化或非甲基化DNA 序列的特异性引物来区分MIR4435-2HG 甲基化。PCR 产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳分离。仅出现甲基化引物的阳性扩增被解释为完全甲基化，同时出现甲基化和非甲基化引物的阳性扩增被视为部分甲基化。……