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正交试验法优化菱角多糖提取工艺

2021-02-03李娇刘悦刘德江张皓孙宏莱程海涛

农学学报 2021年4期
关键词:菱角正交试验多糖

李娇 刘悦 刘德江 张皓 孙宏莱 程海涛

摘要:菱角多糖具多种药理活性。为了优选出热水浸提法提取菱角多糖的最佳工艺条件,本研究以菱角多糖的提取率为指标,选取料液比、提取温度、提取时间为影响因素,在综合单因素实验的基础上,采用L9(34)正交试验进行工艺优化,采用苯酚—硫酸法测定多糖的含量。结果表明:多糖提取率随料液比的增加,呈先升后降的趋势,料液比为1:30时提取率最高,为2.72%;提取温度为70℃时,多糖提取率最高,为2.96%;提取时间为120 min时,提取率最高,为1.81%,之后提取率减少。综合以上单因素试验结果进行正交试验,得到菱角多糖的最佳提取工艺为料液比1:30、温度60℃、时间120 min。热水浸提菱角多糖工艺操作简便易行,具有实用价值,可依据该工艺条件制定菱角多糖提取工艺。

關键词:菱角;多糖;正交试验

中图分类号:S917.3文献标志码:A论文编号:cjas2020-0003

Orthogonal Test Method to Optimize Extraction Technology of Water Chestnut Polysaccharide

Li Jiao, Liu Yue, Liu Dejiang, Zhang Hao, Sun Honglai, Cheng Haitao

(College of Life Science, Jiamusi University, Jiamusi 154007, Heilongjiang, China)

Abstract: Water chestnut polysaccharide has a variety of pharmacological activities. In order to optimize the best process condition for extracting Trapa bispinosa polysaccharide by hot water extraction, in this study, the extraction rate of Trapa bispinosa polysaccharides is taken as an index, and the material-liquid ratio, extraction temperature and extraction time are selected as influencing factors. Based on the comprehensive single-factor experiment, the L9 (34) orthogonal experiment is used to optimize the process, and the phenol-sulfuric acid method is used to determine the polysaccharide content. The results show that the extraction rate of polysaccharide increases first and then decreases with the increase of the ratio of material to liquid. When the ratio of material to liquid is 1:30, the extraction rate is the highest (2.72%). When the extraction temperature is 70℃, the extraction rate of polysaccharide is the highest (2.96%). When the extraction time is 120 minutes, the extraction rate is the highest (1.81%), and then the extraction rate decreased. Based on the above single factor test results, an orthogonal test is carried out, and the best extraction process for Trapa bispinosa polysaccharide is 1:30, the extraction temperature is 60℃, and the extraction time is 120 min. The extraction process of Trapa bispinosa polysaccharide by hot water extraction is simple and practical, and the process of extracting Trapa bispinosa polysaccharide can be formulated according to the process conditions.

Keywords: Trapa bispinosa; Polysaccharides; Orthogonal Test

0引言

菱角(Trapa bispinosa)为菱属植物果实,菱属植物是一种一年生浮叶水生草本植物,生长于热带和亚热带区域的浅水滞水区,广泛分布在全国各地,其中东北地区和长江流域分布最多[1]。菱角中含有多种活性物质,因此菱角提取物具有抗氧化、抗癌、增强免疫力等特性[2]。近年来,人们发现许多植物[3]多糖具有免疫刺激作用,所以菱角多糖具有的免疫活性及抗氧化作用也引起了人们的广泛关注[4-5]。尚庆坤等[6]第一次从菱角壳中提取到了4种多糖化合物,并确定了其单糖组成,分别是阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖和蜜二糖。董向东等[7]、刘阳[8]均探究了菱角多糖的抗氧化活性,即进行了羟基自由基清除实验。

随着分离分析及医药技术的发展,人们越来越重视菱角药用成分和生理活性的研究[9-11],因此对这些成分的提取工艺研究也变得十分必要。刘阳等[12]比较了4种多糖纯化方法对东北菱粗多糖的纯化效果;刘冬敏等[13]采用超声波辅助优化了菱角壳中黄酮、总酚和皂苷的提取条件;侯莉莉等[14]采用响应面法,优化了菱角壳总黄酮的提取工艺;Raza等[15]采用超声辅助响应面法优化了菱茎中多糖的提取条件,并测定了其抗氧化能力。综上,对于菱角多糖水提工艺的研究还鲜有报道,为了更好地开发利用菱角中的多糖资源,本实验采用正交试验法确定了菱角中多糖提取的最优水提工艺,为菱角中多糖的提取及其药材资源开发提供参考。

1材料与设备

1.1材料與试剂

材料:实验所用菱角采集自黑龙江省哈尔滨市依兰县,将其干燥,粉碎待用。

试剂:无水乙醇,苯酚,浓硫酸。

1.2实验设备

UV-8000紫外可见分光光度计,上海元析仪器有限公司;101-1A电热鼓风干燥箱,天津市泰斯特仪器有限公司;JFSD-70实验室粉碎磨,上海嘉定粮油仪器有限公司;800Y全能小钢磨,永康市铂欧五金制品有限公司;FA2004电子天平,上海浦春计量仪器有限公司;DK-98-II电热恒温水浴锅,天津市泰斯特仪器有限公司;R-1001N旋转蒸发仪,郑州长城科工贸有限公司;SHZ-III型循环水真空泵,上海亚荣生化仪器厂;L-550台式低速离心机,长沙湘仪离心机仪器有限公司。

2实验方法

2.1葡萄糖标准曲线的绘制

准确量取105℃恒重干燥2 h的葡萄糖标准品10.0 mg,置于100 mL容量瓶中,加入蒸馏水定容后摇匀,得到浓度为0.1 mg/mL的葡萄糖标准溶液。精密移取浓度0.10 mg/mL葡萄糖标准溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于具塞试管中,加水至2 mL,加入5%的苯酚试液1 mL、浓硫酸5 mL,立即振荡混匀,沸水浴 20 min,冷水冷却10 min,于490 nm处测定吸光度,以吸光度为纵坐标,标准品浓度(mg/mL)为横坐标,绘制标准曲线,得到标准曲线方程,如式(1)。

y=0.7915x+0.008R2=0.9967………………(1)

2.2样品溶液含量的测定

将待测样品稀释10倍后,吸取2 mL,置于10 mL具塞试管中,再分别加入浓度5%的苯酚溶液1 mL、浓硫酸5 mL,立即振荡混匀,反应20 min,于490 nm处测定吸光度。

2.3多糖含量测定方法

采用苯酚-硫酸法[12]测定多糖含量,计算多糖提取率。多糖提取率的计算见公式(2)。

2.4热水浸提单因素实验

2.4.1料液比的选择称取5份3.00 g菱角粉末,分别加入30、60、90、120、150 mL蒸馏水,即料液比分别为1:10、1:20、1:30、1:40、1:50。设置温度60℃,提取时间120 min,提取1次,恒温水浴浸提。将浸提液抽滤,离心(4000 r/min, 10 min),弃掉沉淀留取上清液,将其减压浓缩至一定体积后,加入4倍体积的无水乙醇,于4℃冰箱中醇沉24 h,醇沉液离心(4000 r/min, 10 min),弃去上清液,用蒸馏水溶解沉淀,将其浓缩定容至50 mL待测。之后的实验步骤按照2.3进行操作。

2.4.2提取温度的选择称取5份3.00 g菱角粉末,加入90 mL蒸馏水,分别设置温度40、50、60、70、80℃,提取时间120 min,提取1次,恒温水浴浸提。将浸提液抽滤,离心(4000 r/min, 10 min),弃掉沉淀留取上清液,将其减压浓缩至一定体积后,加入4倍体积的无水乙醇,于4℃冰箱中醇沉24 h,醇沉液离心(4000 r/min, 10 min),弃去上清液,用蒸馏水溶解沉淀,将其浓缩定容至50 mL待测。之后的实验步骤按照2.3进行操作。

2.4.3提取时间的选择称取5份3.00 g菱角粉末,加入90 mL蒸馏水,分别设置时间60、90、120、150、180 min,提取温度60℃,提取1次,恒温水浴浸提。将浸提液抽滤,离心(4000 r/min, 10 min),弃掉沉淀留取上清液,将其减压浓缩至一定体积后,加入4倍体积的无水乙醇,于4℃冰箱中醇沉24h,醇沉液离心(4000r/min, 10 min),弃去上清液,用蒸馏水溶解沉淀,将其浓缩定容至50 mL待测。之后的实验步骤按照2.3进行操作。

2.5正交实验

2.5.1正交实验表头设计在单因素实验的基础上,菱角多糖水提工艺采用三因素三水平设计,以料液比(A)、提取温度(B)、提取时间(C)作为参考因素,按照L9(34)正交表进行菱角多糖水提工艺正交试验。正交设计方案,见表1。

2.5.2样品制备及指标测定分别称取菱角粉末3.00 g,按照正交设计表的各个因素水平进行提取,每组实验1个平行,提取液浓缩定容至10 mL,80%醇沉,4℃冰箱中静置过夜,醇沉液离心(4000 r/min, 10 min),弃去上清液,溶解沉淀,将其浓缩定容至50 mL,以下实验步骤按照2.1操作,计算多糖提取率。

2.6数据处理

采用Excel 2010分析数据,计算标准误差并制图,各提取条件平行测定1次。通过SPSS 21设计正交试验。

3结果与分析

3.1单因素实验结果与分析

3.1.1料液比以料液比和多糖提取率制作曲线,见图1。

从图1可以看出,在5个不同料液比水平上,随着料液比的增加多糖提取率呈现先上升后下降的趋势,在1:30处达到最高,表明料液比过高反而会增加耗能、降低菱角多糖提取率[16],因此选取1:20、1:30、1:40作为正交实验中料液比的3个水平。

3.1.2提取温度以提取温度和多糖提取率制作曲线,见图2。

从图2可以看出,菱角中的多糖提取率于70℃时达到最高,之后开始下降,这一现象说明过高的提取温度可能会导致多糖水解[17],从而导致菱角多糖的提取率下降,因此选取60、70、80℃作为正交实验中提取温度的3个水平。

3.1.3提取时间以提取时间和多糖提取率制作曲线,见图3。

从图3可以看出,多糖提取率随提取时间的增加呈现先上升后下降的趋势,在120 min时多糖提取率最高,考虑到随着时间的延长多糖会逐渐分解[18],分别选取90、120、150 min作为正交实验中提取时间的3个水平。

3.2正交试验结果与分析

菱角多糖提取正交试验结果,见表2。

由表2的直观分析结果可知,提取温度对菱角多糖提取的影响最大,其次是料液比,提取时间的影响最小,即各因素对菱角多糖提取率的主次作用为B>A>C。由表2可得最优组合为A2B1C2,即料液比1:30,提取温度为60℃、提取120 min时,效果最佳。

4讨论

4.1实验材料的选取

菱角在中国的栽培历史悠久,它既可以生食、熟食,还可用于酿酒、入药等。菱角中富含淀粉、蛋白质、氨基酸、多糖等多种活性物质,具有广泛的食用和药用价值[19]。董向东等[7]以提取去壳菱角淀粉后的离心液为原料,采用蛋白酶酶解法制备多糖,优化提取条件,其所用的菱角购自某菜市场,而非野生菱角,且该方法提取多糖较为繁琐。牛凤兰等[20]采用硅胶柱层析法和高效液相色谱法,初步提取和分离了东北菱中的化学成分,但该研究的过程复杂冗长,且需要进行大量的实验。

4.2影响因素的选取

天然糖类常用的提取方法包括热水浸提法、酸浸提法、碱浸提法和生物酶辅助提取法等[21-23],其中热水浸提法是传统的糖类提取方法,相较于其他3种方法,操作更为简单安全。本实验基于正交实验法热水浸提菱角多糖,選取了对水提多糖影响较大的料液比、提取温度、提取时间为影响因素,进行工艺优化。尚庆坤等[6]对菱角多糖进行了提取和结构分析,但未对提取工艺进行优化。侯莉莉等[14]采用响应面法优化了菱角壳总黄酮的提取工艺,但没有对菱角多糖水提工艺进行优化。王鑫[24]以出膏率为指标,加入生物酶辅助提取法,优化了菱角壳水提物的提取工艺,得到菱角壳水提物的最佳提取率为0.175%,与本实验的最佳提取率3.79%差距较大的可能原因有2个:一是菱角的来源不同,且前者使用的是菱角壳,未使用菱角果肉;二是前者计算的是总糖减去还原糖之后的菱角总糖,而本实验计算的是菱角粗多糖。任思堂[25]以菱角多糖提取率为指标,讨论了温度、提取时间、加水量及pH对菱角多糖提取率的影响程度,并确定了最佳的提取工艺,即温度80℃、加水量25倍、pH 7、时间4 h、提取3次。其中,加水量与本实验结果相差不大,造成提取温度和提取时间与本实验存在差异的可能原因,除了实验材料的来源大不相同外,也可能是菱角所处的生长时期以及实验条件的差异所致。另外,本实验未探究提取次数和pH对菱角多糖提取率的影响,因此,在今后的研究中可以探究这2个因素对菱角多糖提取率的影响。

正交实验法优化植物多糖提取工艺的研究已经有过很多报道[26-28],但对于水生植物多糖水提工艺优化的研究还很少。近年来,菱角中生物活性的功能性作用受到了越来越广泛的关注。菱角多糖水提工艺的优化,为其临床研究提供了更有力的保证,但是本实验只提取了菱角中的多糖成分,之后还可对菱角中的成分进行分离鉴定,同时对菱角中代谢物的差异性进行分析,为菱的种质资源保护及功能性资源的开发提供科学依据。

5结论

多糖的提取效率与提取方法、提取温度、提取时间、料液比、设备、材料粉碎度等因素有关,本实验选取了对多糖得率影响较大的料液比、提取温度和提取时间3个因素,通过单因素实验比较了这3个因素对菱角多糖提取率的影响,然后采用正交试验优选出了最佳的水提工艺,结果表明:在60℃提取温度、料液比为1: 30、提取120 min时,菱角多糖的提取率最高,为3.79%。该提取工艺操作简便易行,粗多糖得率高,稳定性好,提高了菱角多糖的经济和综合开发价值,也为进一步开发及利用菱角多糖提供了科学依据。

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