潘崇南 王星钧 金辉

[摘要] 目的 探討基于氨基末端激酶（JNK）/p38通路调控微小RNA-7（miR-7）对幽门螺杆菌（Hp）感染诱导的结直肠癌大鼠的干预作用。 方法 选取60只雄性SD大鼠，15只作为正常组，其余45只建立Hp感染诱导的结直肠癌模型，并随机分为模型组、上调组、下调组各15只。上调组、下调组做miR-7转染。鉴定miR-7转染效率，比较每组检出率，测定Th17/Treg相关因子mRNA表达水平及JNK/p38通路蛋白表达量。 结果 与正常组相比，其他三组miR-7、Foxp3、IL-10表达较低，IL-17A、IL-21、JNK、p38表达较高（P<0.05）;与模型组相比，下调组miR-7、Foxp3、IL-10表达较低，IL-17A、IL-21、JNK、p38表达较高，上调组miR-7、Foxp3、IL-10表达较高，IL-17A、IL-21、JNK、p38表达较低（P<0.05）。 结论 上调miR-7可改善机体的免疫能力，减缓结直肠癌的发生进程，其作用机制可能与JNK/p38通路有关。

[关键词] 结直肠癌;幽门螺杆菌感染;氨基末端激酶;微小RNA-7

[中图分类号] R587.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2021）35-0024-03

Intervention of miR-7 on colorectal cancer rats induced by Hp infection based on JNK/p38 pathway analysis

PAN Chongnan1   WANG Xingjun2   JIN Hui3

1.Department of Infectious Diseases， Taizhou First People′s Hospital in Zhejiang Province， Taizhou   318020， China; 2.Department of Respiratory Medicine， Taizhou First People′s Hospital in Zhejiang Province， Taizhou   318020， China; 3.Department of Gastroenterology， Taizhou First People′s Hospital in Zhejiang Province， Taizhou   318020， China

[Abstract] Objective To explore the intervention effect of microRNA-7 （miR-7） regulated by amino-terminal kinase （JNK）/p38 pathway on colorectal cancer rats induced by helicobacter pylori （Hp） infection. Methods Sixty male SD rats were selected， 15 of them were taken as the normal group， and the other 45 rats were used to establish colorectal cancer models induced by Hp infection， which were randomly divided into model group， up-regulated group and down-regulated group， with 15 rats in each group. The up-regulated group and down-regulated group were transfected with miR-7. The transfection efficiency of miR-7 was identified， the detection rate of each group was compared， and the expression level of Th17/Treg related factors mRNA and JNK/p38 pathway protein were measured. Results Compared with the normal group， the expressions of miR-7， Foxp3， IL-10 were lower in the other three groups， and IL-17A， IL-21， JNK and p38 were higher in the other three groups （P<0.05）. Compared with the model group， the expressions of miR-7， Foxp3 and IL-10 were lower in the down-regulated group， while the expressions of IL-17A， IL-21， JNK and p38 were higher. The expressions of miR-7， Foxp3 and IL-10 were higher in the up-regulated group， while the expression of IL-17A， IL-21， JNK and p38 was lower（P<0.05）. Conclusion Up-regulated miR-7 can improve immunity and slow down the development of colorectal cancer， and its mechanism may be related to JNK/p38 pathway.

[Key words] Colorectal cancer; Helicobacter pylori infection; Terminal kinase; MicroRNA-7

结直肠癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一，近年来发病率逐年上升，且死亡率高，故明确直肠癌的发病机制有助于早期的诊治[1-2]。研究表明[3]，幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）是胃腺癌的致癌因子之一，肠道菌群在早期的直肠癌形成中扮演着重要角色。微小RNA-7（MicroRNA-7，miR-7）成熟体由23个核苷酸组成，在肿瘤中具有重要作用，调控肿瘤细胞的生长、侵袭与转移，且miR-7为肿瘤抑制因子，在结直肠癌的发生、发展中起着重要作用[4-5]。JNK具有致癌作用，其活化的强度与持续的时间不同，可使细胞的反应产生不同结果。p38为有丝蛋白激酶家族成员，可调节细胞的增殖。本研究分析基于JNK/p38通路调控miR-7对Hp感染诱导结直肠癌大鼠的干预作用，以明确miR-7与Hp感染诱导的结直肠癌关系，为临床上结直肠癌的诊治提供参考，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源

1.1.1 研究动物  选取60只SPF级8周龄雄性SD大鼠，购自常州卡文斯实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK（苏）2016-0010，体重（289.26±30.79）g，在相对湿度为29%～35%、温度为（22.96±1.45）℃下饲养1周，每日光照24 h，明暗周期为12 h。本次试验操作均严格参照动物实验伦理要求相关规定进行，且获得我院伦理委员会审批同意。

1.1.2 主要试剂  ELISA试剂盒及相关试剂（上海沪震实业有限公司）;miR-7模拟物、miR-7抑制物（百奥迈科生物技术有限公司）;小鼠抗大鼠JNK抗体（上海将来实业股份有限公司），兔抗人p38抗体（上海一研生物科技有限公司），大鼠抗小鼠β-catenin抗体（上海江莱生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分组与建模  选取15只作为正常组，其余45只大鼠参照相关研究[5]中Hp感染诱导的结直肠癌的建立方法构建模型，采用Hp悉尼株（SS1）液体培养法增菌，冻存菌复苏后将其接种于15%马血清与抗菌药物布氏肉汤中培养，培养环境为N285%，CO2 10%，O25%，放于37℃下以150 r/min振荡培養72 h，随后进行革兰染色观察细菌形态，检测尿霉素、过氧化氢酶和氧化酶为阳性后，将离心细菌浓度调整为1×109 CFU/mL后接种于大鼠，进行5%碳酸氢钠2 mL灌胃，15 min后注入Hp菌液1.5 mL（1×109 CFU/mL），灌胃后所有大鼠禁食12 h，每周感染1次，共5次，最终所有大鼠均建模成功，随机分为模型组、上调组、下调组各15只。

1.2.2 miR-7转染  将所购买的miR-7模拟物（miR-7 mimic，上调）、miR-7抑制物（miR-7 inhibitor，下调）利用Lippofectamine 2000试剂盒稀释为5 mmol/L，将稀释后的miR-7模拟物、miR-7抑制物分别注射于上调组、下调组大鼠胃组织中，正常组、模型组注射同剂量的生理盐水，注射24 h后观察大鼠变化。

1.3 观察指标

实时荧光定量PCR法鉴定miR-7转染效率。先将每组剩余10只大鼠采集静脉血3 mL，之后用常规麻醉提取大鼠结直肠组织，分成3份，1份做组织切片，其他2份保存于液氮中用于后续指标检测。对大鼠结直肠组织进行HE染色，实时荧光定量RT-PCR检测结肠组织中RORγt、IL-17A、IL-21、Foxp3、IL-10、TGF-β表达[6]。Western blot法检测大鼠结直肠组织JNK和p38通路蛋白表达。

1.4 统计学方法

采用SPSS 26.0统计学软件进行分析处理。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差齐性检验，组间比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组miR-7转染效率鉴定比较

经实时荧光定量PCR法鉴定，下调组miR-7表达量降低，上调组miR-7表达量升高，说明miR-7转染成功。见表1。

2.2 各组组织学观察比较

光镜下HE染色显示，正常组与大鼠结肠黏膜完整，未见明显炎症和增生;模型组杯状细胞减少，隐窝增厚，黏膜增生;下调组小鼠结肠上皮损伤，隐窝结构紊乱，溃疡形成，较多淋巴细胞浸润;上调组炎症与溃疡减少，逐渐恢复正常。见封三图1。

2.3 各组Hp检出率比较

与模型组相比，上调组Hp检出率降低，差异有统计学意义（P<0.05）;与下调组相比，上调组Hp检出率降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.4 各组Th17细胞相关mRNA表达水平比较

与正常组相比，模型组、下调组、上调组IL-17A、IL-21表达较高，Foxp3、IL-10表达较低，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组相比，下调组IL-17A、IL-21表达较高，Foxp3、IL-10较低;上调组IL-17A、IL-21表达较低，Foxp3、IL-10表达较高;与下调组相比，上调组IL-17A、IL-21表达较低，Foxp3、IL-10表达较高，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

2.5 各组JNK/p38信号通路蛋白表达量比较

与正常组相比，模型组、下调组、上调组JNK、p38表达量升高，差异有统计学意义（P<0.05）;与模型组相比，下调组JNK、p38表达量升高，上调组JNK、p38表达量降低，与下调组相比，上调组JNK、p38降低，差异有统计学意义（P<0.05）。见表4。

3 讨论

Hp是人类中常见的慢性感染细菌之一，与多种胃部慢性炎症、消化性溃疡及胃癌相关，是胃癌发生的危险因素[7-8]。研究表明[9]，Hp与结直肠癌的发生具有相关性，清除Hp感染可有效降低结直肠癌的发生。

miR-7有miR-7-1、miR-7-2、miR-7-3三种亚型，位于基因组的不同位置，最后的成熟系列均有相同生物学活性[10-11]。研究表明[12]，miR-7在结直肠癌中表达降低，可作为鉴别结直肠良恶性病变的指标之一。本研究结果显示，上调miR-7可干预Hp感染诱导的结直肠癌，病理组织观察显示，其病变逐渐恢复正常，结果提示上调miR-7具有抗Hp感染诱导的结直肠癌的作用。

研究显示，Hp感染影响感染者外周血中Treg细胞比例，与Th17细胞相关因子表达量增高的结直肠癌患者预后差，可通过下调Th17比例减轻大鼠结肠炎[13]。IL-21是一种新发现的细胞因子，参与调节T细胞与B细胞增殖[14]。在结直肠癌大鼠模型中，Treg细胞表达升高，Foxp3是Tregs的影响因子，对Tregs的正常发育及免疫系统平衡具有重要的调节作用，IL-10为重要的免疫负向调节因子，在很多恶性肿瘤细胞中过量表达，不利于恶性肿瘤的免疫治疗[15-16]。本研究结果显示，Hp感染可降低结肠组织中Th17细胞比例，升高Treg细胞比例，通过调节Th17/Treg细胞比例减缓结直肠癌的发展进程。

JNK是广泛存在于细胞内的一组丝氨酸蛋白激酶，对细胞的增殖、分化、凋亡具有调节作用[17]。p38为MAPK家族成员，炎症前因子和应激反应可使p38磷酸化，激活p38，p38活化后可使多种转录因子活化，调节细胞增殖，可促进肿瘤的发生[18]。本研究结果显示Hp感染后JNK/p38通路蛋白表达量升高，而上调miR-7后JNK/p38通路蛋白表达量降低，结果表明Hp感染诱导结直肠癌的发生，其机制与结直肠癌细胞中JNK/p38信号通路被激活有关，调控miR-7可影响Hp感染诱导结直肠癌的发生。

虽然上调miR-7具有抗Hp感染诱导结直肠癌的发生作用，其作用机制可能与抑制JNK/p38 通路相关[19-20]，但仅为本研究结果，临床并未有研究分析其关系，因此本文上述结果还需后续研究进一步验证，为Hp感染诱导结直肠癌的研究提供新方向。

综上所述，在对Hp感染诱导的结直肠癌大鼠做miR-7上调处理后，病变明显被抑制，其作用机制可能与促进JNK/p38通路失活相关。

[参考文献]

[1] 王慧，任建琳，张功，等. 不同部位结直肠癌术后患者生存预后差异分析[J]. 疑难病杂志，2021，20（5）：440-445.

[2] 田慧香，马婕群，张彦兵，等. 肿瘤相关巨噬细胞在结直肠癌转移及治疗中的作用[J]. 医学综述，2021，27（3）：498-502，507.

[3] 宝令玉，魏倩囡，王慧芹，等. 结直肠癌Hp感染与COX-2和G-17及PINP的关系[J]. 中华医院感染学杂志，2021， 31（4）：569-572.

[4] 劉学娟，甘海宁，张丽妹，等. 循环外泌体miRNAs在结直肠癌中的标志作用和临床转化中的挑战[J]. 分子诊断与治疗杂志，2019，11（3）：157-163.

[5] 罗雨，秦安成，黄海，等. miR-7在结直肠癌中的研究进展[J]. 医学综述，2019，25（14）：2740-2745.

[6] 李罗娜，刘芸，张鸿晨，等. 幽门螺杆菌感染对AOM/DSS诱导的小鼠炎症相关性结直肠癌的影响及免疫机制[J]. 中华医学杂志，2020，100（34）：2689-2695.

[7] 付保芹，郭成香，王珊珊，等. 胃癌患者血清miR-204、HSP-70及IL-2与Hp感染及病情关系研究[J]. 中华医院感染学杂志，2020，30（7）：1012-1015.

[8] 关新红，刘婷婷，蔡倩，等. Hp感染与胃癌组织中P=RC2和H3K 27me3 蛋白的相关性分析[J]. 中华医院感染学杂志，2019，29（23）：3539-3543.

[9] Boyuk B，Ozgur A，Atalay H，et al. Helicobacter pylori infection coexisting with intestinal metaplasia is not associated with colorectal neoplasms[J]. Prz Gastroenterol，2019，14（2）：133-139.

[10] 郭静，许玲芬，孙梅. miR-7调控肠三叶因子影响肠上皮细胞增殖和迁移能力[J]. 中国小儿急救医学，2019， 26（4）：280-283.

[11] Agbu P，Cassidy JJ，Braverman J，et al. MicroRNA miR-7 regulates secretion of insulin-like peptides[J]. Endocrinology，2020，161（2）：40.

[12] Adusumilli L，Facchinello N，Teh C，et al. miR-7 controls the dopaminergic/oligodendroglial fate through Wnt/β-catenin signaling regulation[J]. Cells，2020，9（3）：711.

[13] 张晓红，南琼. MicroRNA-7在结直肠癌中的研究进展[J].胃肠病学，2019，24（7）：444-446.

[14] 张琳琳，刘益娟，王承党. 幽门螺杆菌感染对DSS结肠炎小鼠Th17/Treg细胞亚群的影响[J]. 中国微生态学杂志，2021，33（4）：388-393.

[15] 阳梅，严晓琴，冷亚美，等. 急性髓细胞白血病患者外周血单核细胞IL-9、STAT3和miR-21的表达及意义[J]. 河北医药，2020，42（23）：3538-3542.

[16] 颜春辉，于燕妮，郭莉莉. 结直肠癌组织STAT3、Foxp3、IL-6表达与临床病理特征的相关性[J]. 贵州医科大学学报，2021，46（1）：85-90.

[17] 孙志刚，曾宝珠，焦勤书，等. 原发性肝癌患者索拉非尼联合TACE术治疗的有效性及对患者HIF-1α、VEGF、IL-10、IFN-γ的影响[J]. 实用癌症杂志，2021，36（5）：810-813.

[18] 闫云静，王帅，穆云萍，等. FKBP38蛋白对人源子宫内膜癌细胞增殖及侵袭的调控[J]. 中国药理学通报，2020，36（8）：1140-1145.

[19] 徐乃喜，赵蕾，吕杨波，等. 幽门螺杆菌感染对诱导结直肠癌发生的影响及其机制的动物试验研究[J]. 中华医院感染学杂志，2019，29（17）：2678-2682.

[20] 信洪利，张艳芝，黄秀莲. Hp感染对儿童血红蛋白、胃动素和胃泌素水平的影响[J]. 国际检验医学杂志，2020， 41（14）：1781-1783.

（收稿日期：2021-07-07）

[基金项目] 浙江省医药卫生科技计划项目（2020KY1044）