张玉星，朱凯，俞仲贤，凌云，周春祥

1.南京中医药大学，江苏南京210000；2.张家港市中医医院，江苏张家港215000；3.常熟市第一人民医院，江苏常熟215000

近年来的统计表明，全球胃肠道肿瘤占肿瘤发病率的40%左右，是威胁人类健康的第二大肿瘤疾病［1］。常规治疗手段主要是手术切除配合放、化疗，对患者的身体素质有一定要求，且化疗存在细胞毒性，对机体不良反应多，会导致一系列免疫下降、消化道反应［2］。研究表明，肠道菌群与肿瘤的发生发展有着密切联系［3-4］，结直肠癌患者的肠道菌群与正常人群存在显著差异［5］，癌症患者的致病菌丰度显著增多［6-7］，且菌群会随着癌症的发展而变化［8-9］，将结直肠癌患者肠道菌群移植至无菌小鼠，可引起小鼠结肠炎甚至结肠癌的产生，说明菌群失调可诱发癌症［10］，在免疫疗法中肠道菌群也起到一定作用［11］。

在中医理论中，化疗药物属“火毒”“药毒”范畴，伤津耗气。在临床上发现多数患者经过化疗之后会出现咽干口燥、神疲乏力、少气懒言、舌红少津等气阴两虚症状。化疗会导致菌群丰度及多样性降低，条件致病菌增多［12］，虽达到杀伤肿瘤细胞的目的，但同时可能是肿瘤复发或转移的原因之一。

益气养阴方由苏叶、佛手、枳壳、茯苓、太子参、麦冬、薏苡仁、白术、石斛组成，可有效缓解气阴两虚症状，兼扶正固本。药理学上太子参［13-14］、茯苓［15-16］、石斛［17-18］、薏苡仁［19-20］、白术［21］等具有调节免疫功能的作用。有动物实验证明，此方能增强免疫抑制模型小鼠的体液免疫、细胞免疫、非特异性免疫功能，促进小鼠的胃肠蠕动［22-23］。本研究观察了益气养阴方对胃肠道肿瘤化疗后出现气阴两虚症状患者的具体生理生化指标及肠道菌群变化，推测可能的作用机制，为今后更广泛的临床应用提供证据。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2018年8月至2019年12月在江苏省张家港市中医医院肿瘤科及常熟市第一人民医院中医科就诊的患者100例，随机分为益气养阴方高剂量组、益气养阴方低剂量组和安慰剂组，每组分别为34例、32例和34例，各组基本信息见表1。为了比较患者与健康人群的菌群差异，另取30位健康志愿者（来自张家港市中医医院的体检科）的粪便作为正常肠道菌群指标，年龄（60.97±3.33）岁；男19人，女11人。本研究经过南京中医药大学附属医院医学伦理委员会同意，所有患者均对本试验知情并签署知情同意书。

1.2 病例纳入与排除标准纳入标准:①胃肠道肿瘤患者经过手术治疗后；②经过两次化疗，即将开始第3次化疗；③预计能够存活3个月或者以上；④卡氏评分≥60分；⑤使用常规化疗药治疗，如:奥沙利铂、卡培他滨、多西他赛、雷替曲塞等；⑥根据1994年国家中医药管理局颁布的《中医病证诊断疗效标准》，属于气阴两虚证。

表1 各组患者一般资料比较（±s，例）

表1 各组患者一般资料比较（±s，例）

岁男 女 胃癌 结直肠癌益气养阴方高剂量组组别n 年龄/34 62.41±8.10 22 12 13 21益气养阴方低剂量组32 62.94±9.40 21 11 17 15安慰剂组34 63.82±5.89 23 11 20 14

排除标准（自拟）:①摄食困难；②近1个月内使用免疫调节剂；③有明确躯体及精神心理疾病的患者；④患有严重高血压、心脏病以及糖尿病等其他合并病种。

1.3 治疗方法根据动物实验结果，对小鼠效果显著的两个剂量分别是相当成人半日的用药量和成人1日的用药量［22-23］，据此设立益气养阴方低剂量组与益气养阴方高剂量组，分别每日摄入半日用药量即1支口服液与1日用药量即两支口服液。益气养阴方组成:紫苏叶、佛手、枳壳、茯苓、太子参、麦冬、薏苡仁、白术、石斛。以上诸药提取为浸膏（南京中医药大学药学院提供），成人每人每日用量5.26 g。为方便试验，后经北京海德润医药集团有限公司提纯萃取浓缩后，制成口服液，每两支口服液含药量为成人1日用量。安慰剂组每日服用两支安慰剂，安慰剂由北京海德润医药集团有限公司提供。

1.4 观察指标分别于治疗前、治疗后采集患者外周静脉血测定各指标。骨髓抑制指标利用全自动血细胞分析仪测定，肝肾功能检查是利用全自动生化分析仪测定，肿瘤标记物是分离血清后利用化学发光免疫测定法检测，细胞免疫指标（CD3+、CD4+、CD8+）采用流式细胞仪检测。以上均由张家港市中医医院检验科和常熟市第一人民医院检验科完成检测。

1.5 粪便菌群检测采集健康组、患者服药前后的粪便，-80℃冰箱保存，由广州基迪奥生物有限公司进行16S rRNA测序。实验流程为:使用HiPure Stool DNA Kits（粪便DNA提取试剂盒）抽提样本中DNA，以引物对341F:CCTACGGGNGGCWGCAG；806R:GGACTACHVGGGTATCTAAT扩增16 s rDNA的V3+V4区，切胶回收PCR扩增产物，连接测序接头，构建测序文库，使用iseq2500 PE250测序平台测序。所有样本测序深度都达到饱和。用Uparse软件对所有样品的全部Effective Tags序列聚类，将97%一致性的序列聚类，成为OTUs（Operational Taxonomic Units）结果，与数据库中序列一致性为97%以上的序列认为属于相同种类。

1.6 统计学方法采用Microsoft Excel 2010软件进行图表制作，采用SPSS 20.0软件对样本的生理生化指标、肠道菌群进行统计分析，实验所得数据均采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组患者治疗前后肝肾功能、骨髓抑制、肿瘤指标比较各组患者治疗前后肝肾功能、骨髓抑制指标和肿瘤标记物采用t检验分析发现，差异均无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 各组患者治疗前后免疫功能比较治疗后，益气养阴方高剂量组CD3+由（61.59±7.73）%提高至（64.04±8.45）%（t＝-2.130 4，P＝0.040 9），CD4+/CD8+比值由1.21±0.41提高至1.47±0.76（t＝-2.048 9，P＝0.049 9）；益气养阴方低剂量组CD4+/CD8+比值由1.27±0.50提高至1.70±0.92（t＝-2.384 0，P＝0.023 4）。见表2。

表2 各组患者治疗前后免疫功能比较（±s）

表2 各组患者治疗前后免疫功能比较（±s）

指标益气养阴方高剂量组（n＝34）益气养阴方低剂量组（n＝32）安慰剂组（n＝34）治疗前治疗后CD3+61.59±7.73 64.04±8.45 62.42±7.40 65.28±9.0治疗前治疗后治疗前治疗后3 62.33±9.56 65.76±13.57 t值，P值-2.130 4，0.040 9-1.788 8，0.083 4-1.741 5，0.091 2 CD4+38.09±7.58 38.63±7.95 40.85±8.74 41.89±9.54 40.29±9.52 39.82±13.57 t值，P值-0.360 7，0.720 7-0.703 5，0.487 0 0.365 6，0.717 0 CD4+/CD8+1.21±0.41 1.47±0.76 1.27±0.50 1.70±0.92 1.42±0.70 1.67±0.77 t值，P值-2.048 9，0.049 9-2.384 0，0.023 4-1.932 8，0.063 1

2.3 各组患者治疗前后肠道菌群特征分析因样本质量因素，最终得到益气养阴方高剂量组、益气养阴方低剂量组和安慰剂组肠道菌群数据的样本数分别为30例、30例、31例，健康组30人。

2.3.1 癌症类型、性别对菌群的影响依据性别、癌症类型将入选患者分组，使用双样本异方差t检验比较其门水平上肠道菌群结构及丰度，结果显示，差异均无统计学意义（P＞0.05），见表3。因此，肠道菌群数据分析不考虑性别及癌症类型。

表3 癌症类型、性别对患者粪便菌群影响（±s）

表3 癌症类型、性别对患者粪便菌群影响（±s）

癌症类型/性别n 厚壁菌门拟杆菌门变形菌门放线菌门胃癌45 54.30±30.13 18.81±24.06 24.27±29.30 2.23±2.56结直肠癌46 58.91±25.51 17.66±21.44 16.81±22.70 5.29±10.29 t值，P值-0.777 6，0.438 9 0.238 4，0.812 2 1.325 6，0.188 7-1.935 2，0.058 5女性29 51.44±31.32 20.81±25.71 23.60±30.06 3.70±4.76男性62 59.06±25.93 17.02±21.16 19.20±24.33 3.81±8.73 t值，P值1.122 9，0.267 3-0.680 2，0.499 8-0.679 2，0.500 5 0.078 2，0.937 8

2.3.2 癌症组（癌症患者）与健康组肠道菌群多样性比较以sobs、shannon、simpson、chao和ace指数作为个体肠道菌群多样性的评判指标，比较胃肠道肿瘤化疗后患者与健康组肠道菌群多样性，癌症患者菌群多样性低于健康组，差异均有极显著统计学意义（P＜0.01），见表4。

2.3.3 癌症患者肠道菌群结构使用异方差t检验比较患者与健康组之间菌群结构差异，发现患者厚壁菌门（56.69±27.99）%显著低于健康组（70.73±12.01）%（t＝-3.812 9，P＝0.000 2），变形菌门（20.52±26.44）%显著高于健康组（4.92±6.98）%（t＝-5.112 9，P＝0.000 001），放线菌门（3.77±7.69）%显著高于健康组（1.40±1.22%）（t＝2.820 6，P＝0.005 8），拟杆菌门（18.25±22.78）%与健康组（22.91±11.41）%比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见图1。

表4 癌症患者与健康组肠道菌群多样性比较（±s）

表4 癌症患者与健康组肠道菌群多样性比较（±s）

sobs shannon simpson chao ace健康组30 321.77±29.21 4.74±0.46 0.91±0.03 385.62±组别n 29.14 392.54±31.38癌症组91 260.05±65.81 3.64±1.11 0.78±0.17 328.83±77.09 327.17±73.77 t值，P值-7.008 3，0.000 0-7.612 5，0.000 0-7.021 0，0.000 0-5.817 0，0.000 0-6.727 3，0.000 0

图1 胃肠道癌症患者化疗后与健康组肠道菌群组成结构差异比较（±s）

2.4 益气养阴方对患者肠道菌群的影响

2.4.1 各组患者治疗前后肠道菌群多样性比较

各组患者治疗前后菌群多样性比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表5。

2.4.2 各组患者治疗前后肠道菌群门水平丰度比较患者治疗前后肠道菌群采用成对t检验比较，发现在门水平上益气养阴方高剂量组变形菌门由（29.37±31.80）%下降至（18.70±25.67）%（t＝2.215 4，P＝0.035 4）。见表6。

使用成对t检验比较患者治疗前后优势菌属的变化发现，益气养阴方高剂量组变形菌门中埃希-志贺菌属由（10.74±16.66）%下降至（3.66±7.71）%（t＝2.091 6，P＝0.047 7），安慰剂组埃希-志贺菌属由（4.01±6.76）%上升至（4.61±6.77）%（t＝-2.072 4，P＝0.047 6）。见表7。

表5 各组患者治疗前后肠道菌群多样性比较（±s）

表5 各组患者治疗前后肠道菌群多样性比较（±s）

sobs shannon simpson chao ace益气养阴方高剂量组 30 治疗前243.47±65.06 3.66±1.13 0.79±0.16 310.70±74组别n 时间.55 308.55±67.51 30 治疗后256.90±65.76 3.87±1.12 0.81±0.14 321.97±78.41 318.45±72.59 t值，P值-1.290 6，0.207 0 -1.063 6，0.296 3 -0.952 4，0.348 8 -0.894 3，0.378 5 -0.888 6，0.381 5益气养阴方低剂量组 30 治疗前254.03±61.49 3.47±1.17 0.74±0.19 320.03±75.57 319.72±72.60 30 治疗后247.27±52.96 3.68±1.10 0.79±0.15 316.86±67.73 315.23±69.35 t值，P值0.659 6，0.514 7 -1.277 4，0.211 6 -1.750 4，0.090 6 0.265 5，0.792 5 0.379 4，0.707 2安慰剂组31 治疗前281.94±64.63 3.78±1.01 0.80±0.15 354.90±73.94 352.40±73.73 31 治疗后260.42±60.77 3.89±1.11 0.81±0.16 336.94±80.73 333.30±78.13 t值，P值1.773 4，0.086 3 -0.547 1，0.588 4 -0.685 1，0.498 6 1.148 3，0.259 9 1.3390，0.190 6

表6 各组患者治疗前后肠道菌群门水平丰度比较（±s）

表6 各组患者治疗前后肠道菌群门水平丰度比较（±s）

时间厚壁菌门拟杆菌门变形菌门放线菌门健康组-70.73±12.01 22.91±11.41 4.92±6.98 1.40±1.组别n 22益气养阴方高剂量组30治疗前47.17±29.62 20.04±24.03 29.37±31.80 3.16±3.24 30治疗后48.90±29.54 22.26±24.57 18.70±25.67 4.85±8.81 t值-0.318 2-0.824 7 2.215 4-1.074 4 P值0.752 6 0.416 3 0.035 4 0.291 5益气养阴方低剂量组30治疗前61.38±25.96 13.28±20.52 18.94±23.99 5.79±12.13 30治疗后69.42±17.32 11.95±12.96 12.21±15.61 5.93±8.42 t值-1.709 4 0.538 9 1.420 0-0.071 2 P值0.098 1 0.594 0 0.166 3 0.943 7安慰剂组31治疗前61.19±25.86 21.28±22.82 13.98±20.51 2.41±3.83 31治疗后57.49±25.95 18.46±19.17 19.85±27.09 2.42±2.60 t值0.558 2 0.772 5-0.920 6-0.008 8 P值0.580 9 0.445 9 0.364 6 0.993 0

表7 各组患者治疗前后肠道菌群属水平丰度比较（±s）

表7 各组患者治疗前后肠道菌群属水平丰度比较（±s）

志贺菌属组别n时间埃希-健康组1.40±4.16益气养阴方高剂量组30 治疗前10.74±16.66 30 治疗后3.66±7.71 t值2.091 6 P值0.047 7益气养阴方低剂量组30 治疗前9.97±15.46 30 治疗后6.04±10.51 t值1.873 8 P值0.071 1安慰剂组31 治疗前4.01±6.76 31 治疗后4.61±6.77 t值-2.072 4 P值-0.047 6

2.4.3 各组患者治疗前后变形菌门丰度比较由于肠道菌群个体差异较大，考虑到变形菌门为条件致病菌，在肠道慢性炎症中起到重要作用。参照健康组变形菌门丰度均在12%以下，以12%为分组标准，将各组患者进一步分为高变形菌门组（≥12%）和低变形菌门组（＜12%），减少个体差异，比较确定益气养阴方对变形菌门及该门中的埃希-志贺菌属的影响。

成对t检验比较发现，益气养阴方高剂量组中的高变形菌门组的变形菌门由（50.33±29.40）%降低至（19.39±20.41）%（t＝2.304 0，P ＝0.035 9），埃希-志贺菌属由（19.39±20.41）%降低至（4.28±6.04）%（t＝2.283 1，P＝0.045 5）；益气养阴方低剂量组中的高变形菌门组的变形菌门由（46.59±23.85）%降低至（19.24±12.97）%（t＝2.919 2，P＝0.017 1），埃希-志贺菌属由（25.63±18.39）%降低至（13.66±13.84）%（t＝2.445 6，P＝0.037 0）；安慰剂组中低变形菌门组的变形菌门由（4.63±2.75）%上升至（21.26±30.61）%（t＝-2.437 9，P ＝0.023 7），埃希-志贺菌属由（0.66±0.64）%上升至（4.59±7.98）%（t＝-2.161 6，P＝0.043 6）。见表8。

表8 益气养阴方对不同丰度的变形菌门的影响（±s）

表8 益气养阴方对不同丰度的变形菌门的影响（±s）

组别n时间变形菌门t值P值埃希-志贺菌属t值P值50.33±29.40 19.39±20.41 16 治疗后19.39±20.41 2.304 0 0.035 9 4.28±6.04 2.283 1 0.045 5益气养阴方高剂量组-变形菌门丰度低组14 治疗前5.02±2.71 1.61±2.55 14 治疗后6.49±4.52-0.879 5 0.396 4 6.24±16.77-0.988 2 0.341 1益气养阴方低剂量组-变形菌门丰度高组10 治疗前46.59±23.85 25.63±18.39 10 治疗后19.24±12.97 2.919 2 0.017 1 13.66±13.84 2.445 6 0.037 0益气养阴方低剂量组-变形菌门丰度低组20 治疗前5.08±2.37 6.66±13.51 20 治疗后3.36±1.87 0.491 8 0.628 5 2.07±5.15 0.051 6 0.959 4安慰剂组-变形菌门丰度高组9治疗前36.84±26.35 12.13±7.70 9治疗后16.41±14.89 1.996 7 0.080 9 14.31±15.62-0.512 6 0.622 1安慰剂组-变形菌门丰度低组22 治疗前4.63±2.75 0.66±0.64 22 治疗后21.26±30.61-2.437 9 0.023 7 4.59±7.98-2.161益气养阴方高剂量组-变形菌门丰度高组16 治疗前6 0.043 6

3 讨论

3.1 益气养阴方对胃肠道肿瘤化疗后患者血液指标的影响益气养阴方高剂量组CD3+显著升高，益气养阴方各剂量组CD4+/CD8+比值均显著上升。CD3+代表了T细胞的增殖或成熟，CD4+/CD8+代表辅助性T细胞与杀伤性T细胞之间的平衡，当体内存在慢性炎症反应时，CD8+细胞数量增多，CD4+/CD8+比值下降［24］，提示按高剂量服用益气养阴方在抑制炎症的同时还能够改善患者免疫功能。

3.2 胃肠道肿瘤化疗后患者与健康组比较化疗后，肠道菌群多样性显著低于健康组（P＜0.05），菌群组成上变形菌门占比显著高于健康组（P＜0.05），与已有研究结果类似［12，25］。变形菌门为革兰阴性菌，外膜由脂多糖组成，能够激活核因子κB信号通路，引起炎症。该类菌过度增殖会导致肠道缺氧，肠上皮功能障碍，抑制有益菌增殖，破坏肠道内正常菌群结构，干扰正常抗炎机制［26］。研究表明，炎症反应会阻碍肿瘤的治愈进程［27-28］。因此，在肿瘤治疗过程中应抑制能够引起并加重炎症的菌群增殖。仔细观察患者菌群数据发现，并非所有患者都具有变形菌门异常增多的表达，因此，以变形菌门作为指示菌，进一步分析益气养阴方的作用。

3.3 益气养阴方对胃肠道肿瘤化疗后患者肠道菌群的影响服药后对患者菌群多样性并无显著提升，但观察到益气养阴方高剂量组多样性指标增大，安慰剂组下降，但差异无统计学意义（P＞0.05），也许与服药时间较短有关。益气养阴方高剂量组变形菌门、埃希-志贺菌属菌显著降低，安慰剂组显著增多。已知埃希-志贺菌属为变形菌门中较为确定的致病菌，能够诱发并延长炎症反应，在结直肠肿瘤患者中丰度较高［29］。为进一步确定益气养阴方对变形菌门的影响，将各组患者细分为高变形菌门组和低变形菌门组，结果显示，益气养阴方各剂量均可显著降低组中的高变形菌门组的变形菌门和埃希-志贺菌属，对组中的低变形菌门组则无显著作用；而安慰剂组的低变形菌门组的变形菌门和埃希-志贺菌属显著上升。以上提示益气养阴方对患者菌群的改变主要是变形菌门及该门中的埃希-志贺菌属，可降低其过度增殖，改善肠道微环境。

综上，益气养阴方可改善胃肠道肿瘤化疗后患者的免疫功能及肠道菌群，高剂量即成人1日用量效果更好，可长期服用。