邢锡熙，吴绍钦，沈存思，李建香，王益俊，严晶

1.南京市江宁区中医医院，江苏南京211100；2.南京中医药大学第一临床医学院中医儿科学研究所/江苏省儿童呼吸疾病（中医药）重点实验室，江苏南京210023；3.南京中医药大学附属南京中医院，江苏南京210001；4.南京中医药大学第一临床医学院代谢病中医研究重点实验室，江苏南京210023

急性脑出血（acute intracerebral hemorrhage，AICH）约占急性脑血管病的10% ～20%，其发病率、复发率、病死率和致残率高，给社会和家庭带来沉重的负担［1］。除了急性期颅内血肿对脑组织造成压迫，产生占位效应及其分解产物造成脑组织损伤外，继发性的脑水肿和炎症反应等亦会加重脑损伤［2］。西医内科多采用脱水、利尿、降颅压等方法，外科多以清除血肿、去骨瓣降颅压等治法为主，但会遗留除疾病本身以外手术创伤带来的合并症［3］。虽然目前已有一些针对炎症因子的药物，如肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）抑制剂等，但仍处于试验阶段［4］。中医以辨证论治为基础，复方见长。诸多研究发现，联合中药治疗可显著提高临床疗效［5］。课题组所拟中风1号方具有凉血活血、通腑泄热、开窍通络、上下并治之功，联合应用后临床疗效显著。本文主要观察其对神经损伤、脑水肿、血脑屏障、炎症因子的影响，初步揭示其神经保护作用机制。

1 材料

1.1 动物SD雄性大鼠144只，清洁级，体质量200～250 g，南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供［动物合格证号:SCXK（苏）2017-0001］，饲养于南京中医药大学动物实验中心。室温23～25℃、相对湿度65% ～70%，饲养环境清洁、安静。大鼠自由饮水、饮食，适应性饲养1周后再进行实验。

1.2 药物及试剂中风1号方由生大黄10 g，生地黄10 g，牡丹皮12 g，三七3 g，全瓜蒌15 g，石菖蒲10 g组成。购于南京市江宁区中医医院中药房，按传统方法煎煮熬制，浓缩至含0.54 g·mL-1生药的药液，调整pH至7.0，无菌操作过滤除菌后，4℃冰箱保存备用。伊文思蓝（Evans Blue，EB）（Solarbio，货号:E8010）；大鼠TNF-αELISA试剂盒（福麦斯生物，货号:ELR010）；大鼠IL-1βELISA试剂盒（福麦斯生物，货号:ELR002）。

1.3 仪器脑立体定位仪（北京智鼠多宝，型号:DB053）；微量进样器（上海高鸽，50μL）；酶标仪（优利特，型号:URIT-660）；电子天平［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］；电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司，型号:WGL-125B）。

2 方法

2.1 AICH模型的建立采用自体尾部血液注入法造模。0.4%的戊巴比妥钠（1 mL·100 g-1）腹腔注射麻醉后断尾取血，用微量进样器（预先用1‰肝素钠冲洗）抽取自体不凝血50μL备用。将大鼠以俯卧位用立体定位仪固定在操作台上，使前后囟处于同一平面，门齿沟的水平与耳间线比较低2.4 mm。沿头皮正中纵行切开约10 mm，暴露颅骨，依据《脑立体定位图谱》定位尾壳核。将微量进样器固定在立体定位仪上，将微量进样器尖端垂直于矢状缝右侧旁开3.0 mm，前囟前0.2 mm处，用三棱针在正对针尖下方钻一直径约1.0 mm的小孔，深度达硬脑膜表面，调整上下坐标尺，以颅骨外板为零点，使微量进样器进针深度为6.0 mm。按照5μL·min-1的速度，缓慢匀速地将大鼠自体血加50μL注入至尾壳核内，注血完成留针约15 min后再缓慢地退针，用骨蜡对钻孔进行封闭后缝合手术切口，进行常规消毒后将大鼠侧卧位放置于单独的鼠笼。假手术组只行进针，不注入自体血，手术操作同其余各组。以上操作均遵守无菌原则。

2.2 分组及给药将造模成功的大鼠随机分成3组，每组各36只，即模型+生理盐水组、模型+中风1号方低剂量组、模型+中风1号方高剂量组，假手术组共36只。并按照指标检测的时间不同分为24 h、72 h两个亚组，每亚组随机分配18只大鼠，用于检测不同指标。给药剂量根据体表面积折算，低剂量相当于成人每日等效剂量（75 g·0.018·0.2 kg-1＝6.75 g·kg-1），低、高剂量比为1∶2。假手术组、模型组（24 h、72 h）均予以等量生理盐水，灌胃容积均为10 mL·kg-1，低剂量组每日1次，高剂量组每日2次。各组的灌胃疗程均以各亚组的时间（24 h、72 h）为准。

2.3 检测指标

2.3.1 神经行为学评分造模结束及各时间点给药结束后，均参照Longa 5级评分法评估神经功能损伤程度［6］。评分标准为:0分，无神经功能缺损症状；1分，提尾倒挂时血肿对侧前肢紧贴胸壁不能伸展；2分，行走时向血肿对侧转圈；3分，行走或站立时向血肿对侧倾倒；4分，意识障碍，不能行走。评分为1～3分认为造模成功，0分则认为造模失败，4分和死亡大鼠均被剔除实验并根据分组进行相应补充。

2.3.2 脑水肿检测采用干湿重法检测脑含水量。分别于24 h、72 h，每组随机选择6只大鼠予0.4%戊巴比妥钠（1 mL·100 g-1）腹腔注射麻醉后断头，用钳剥开硬脑膜，取出整个大脑滤干。沿中线将脑组织切成两半，再沿穿刺针眼纵切一刀见到水肿，取血肿周围脑组织约150 mg（湿重），置于100～110℃的干燥箱中，24 h后体质量恒定称重（干重）。

脑组织含水量（%）＝（湿重-干重）/湿重×100%

2.3.3 血脑屏障通透性检测每组随机选择6只大鼠按上法麻醉后，由尾静脉注入4 mL·kg-1的2%EB溶液，当大鼠眼球结膜、四肢变蓝时，说明EB注入成功。2 h后，开胸通过左心室灌注生理盐水，直到右心房流出无色液体为止。大鼠断头取脑之后，取血肿周围组织，称重后加入3 mL的甲酰胺，置于54℃的恒温水浴箱中孵育24 h。对溶有EB的甲酰胺溶液进行过滤，用分光光度计（λ＝632 nm）测其吸光度值。根据EB标准曲线计算脑组织EB的含量。

2.3.4 ELISA法检测TNF-α、IL-1β水平每组剩余的6只按上述方法麻醉后，用钳剥开硬脑膜，取出待测出血周围脑组织，检测TNF-α、IL-1β水平。在酶标仪上测450 nm波长处吸光度（OD值），计算样本浓度。

2.4 统计学方法采用SPSS 20.0统计软件，原始数据用±s表示，符合正态分布采用One-Way ANOVA检验，不符合正态分布用Wilcoxon秩和检验。以P＜0.05作为有统计学意义。

3 结果

3.1 中风1号方对AICH模型大鼠神经功能的影响与假手术组相比，模型组大鼠24 h、72 h神经行为学评分均显著增加（P＜0.01）。与模型组相比，中风1号方低、高剂量组大鼠24 h神经行为学评分有降低的趋势（P＞0.05）；中风1号方低、高剂量组大鼠72 h神经行为学评分降低（P＜0.05，P＜0.01）。见表1。

表1 中风1号方对各时间段AICH模型大鼠神经行为学评分的影响（分，±s）

表1 中风1号方对各时间段AICH模型大鼠神经行为学评分的影响（分，±s）

注：与同时段假手术组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与同时段模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

24 h 72 h假手术组组别0.00±0.00 0.00±0.00模型组2.50±0.55##1.83±0.41##中风1号方低剂量组2.33±0.52 1.16±0.41△中风1号方高剂量组2.17±0.41 1.00±0.63△△

3.2 中风1号方对AICH模型脑组织含水量的影响与假手术组相比，模型组大鼠24 h、72 h脑组织含水量均增加（P＜0.05，P＜0.01）。与模型组相比，中风1号方低、高剂量组大鼠24 h脑组织含水量有降低的趋势（P＞0.05）；中风1号方低、高剂量组大鼠72 h脑组织含水量降低（P＜0.05，P＜0.01）。见表2。

表2 中风1号方对各时间段AICH模型大鼠脑组织含水量的影响（%，±s）

表2 中风1号方对各时间段AICH模型大鼠脑组织含水量的影响（%，±s）

注：与同时段假手术组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与同时段模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

24 h 72 h假手术组组别67.75±5.75 68.37±4.97模型组75.44±4.94#81.49±3.02##中风1号方低剂量组72.00±4.94 74.20±4.53△中风1号方高剂量组70.10±1.45 72.38±2.47△△

3.3 中风1号方对AICH模型血脑屏障的影响

与假手术组相比，模型组大鼠24 h、72 h脑组织EB水平均增加（P＜0.05，P＜0.01）。与模型组相比，中风1号方高剂量组大鼠24 h脑组织EB水平显著降低（P＜0.01）；中风1号方低、高剂量组大鼠72 h脑组织EB水平均显著降低（P＜0.01）。见表3。

表3 中风1号方对各时间段AICH模型大鼠脑组织EB水平的影响（μg·g-1，±s）

表3 中风1号方对各时间段AICH模型大鼠脑组织EB水平的影响（μg·g-1，±s）

注：与同时段假手术组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与同时段模型组比较，△△P＜0.01

24 h 72 h假手术组组别9.70±0.37 9.81±0.52模型组20.00±0.98#29.21±1.78##中风1号方低剂量组18.61±0.74 21.37±1.69△△中风1号方高剂量组16.60±0.45△△17.91±1.13△△

3.4 中风1号方对AICH模型大鼠脑血肿旁组织炎症因子的影响与假手术组相比，模型组大鼠24 h、72 h脑血肿旁组织TNF-α、IL-1β水平均显著增加（P＜0.01）。与模型组相比，中风1号方高剂量组大鼠24 h脑血肿旁组织TNF-α、IL-1β水平显著降低（P＜0.01）；中风1号方低、高剂量组大鼠72 h脑血肿旁组织TNF-α、IL-1β水平显著降低（P＜0.01）。见表4。

表4 中风1号对AICH模型大鼠脑血肿旁组织TNF-α、IL-1β的影响（pg·mL-1，±s）

表4 中风1号对AICH模型大鼠脑血肿旁组织TNF-α、IL-1β的影响（pg·mL-1，±s）

注：与同时段假手术组比较，##P＜0.01；与同时段模型组比较，△△P＜0.01

组别24 h TNF-αIL-1β 72 h TNF-αIL-1β 5±37.57模型组1146.19±111.04##1209.49±138.93##994.83±159.07##1066.40±175.96##中风1号方低剂量组1073.17±123.71 1051.21±95.94 754.28±119.20△△811.52±61.44△△中风1号方高剂量组930.57±73.72△△832.40±102.58△△660.17±138.30△△619.18±71.14假手术组68.51±15.38 387.44±36.99 73.26±10.37 413.6△△

4 讨论

脑出血归属于中医学“出血性中风”范畴。既往中医治法有活血化瘀法、破瘀涤痰法、通腑法、复元醒脑法、解毒活血法、凉血通瘀法等［7］。课题组秉承国医大师周仲瑛教授学术思想，认为“离经之血便是瘀”“治风先治血，血行风自灭”，因此瘀血证候贯穿于出血性中风整个过程。瘀血日久郁而化热，而致瘀热搏结阻于脑窍，瘀热搏结不解，则热愈炽，瘀益甚，气机愈壅，进而化火、生风、成痰（水），三者互为因果兼夹，终致风火相煽，痰瘀闭阻于脑窍，而致脑髓受损，神机失用［8，9］。治则当急则治其标，以凉血通瘀为治疗大法。所拟中风1号方，以生大黄为君药，凉血逐瘀，通腑泄热，实际运用中无论有无腑实证候，均可应用，以下为度；臣以生地黄清热凉血、养阴生津，以治瘀热相搏所致之伤阴耗血，牡丹皮、三七凉血活血散瘀，既可阻断血中之热煎熬成瘀，又可防瘀热生风化痰，佐以瓜蒌，清热化痰，润肠通便，使以石菖蒲，芳香走窜、开窍豁痰、醒神益智、引药上行以达巅顶。全方共奏凉血活血、通腑泻热、开窍通络、上下并治之功。

现代医学认为，脑部炎症在血脑屏障受损、脑组织损伤、神经细胞凋亡等方面发挥了重要作用［10］。田婷等进行了脑出血瘀热机元的生物标志物的研究，发现“热”机素主要与炎症反应有关，TNF-α、IL-1β明显升高［11］。王昀应用人全基因组表达谱芯片筛选脑出血中风急性期“瘀热阻窍证”患者和非“瘀热阻窍证”患者基因的差异表达，发现34条与炎症因子相关的信号通路发生了变化，其中与TNF-α等差异明显［12］。TNF-α可干扰细胞外谷氨酸星形胶质细胞的去除导致继发性脑损伤，加剧兴奋性毒性，激活小胶质细胞，诱导NF-κB活化，加重炎性反应产生级联效应，亦能增强炎症细胞粘附作用，进一步导致脑血管结构、血脑屏障受损［13-14］。IL-1β主要是脑出血后继发性脑损伤刺激星形细胞、胶质细胞和内皮细胞所分泌，且能进一步激活星形胶质细胞、巨噬细胞，破坏血脑屏障，促进神经细胞凋亡［13，15］；另一方面，IL-1β又诱导免疫细胞产生继发性细胞因子等，诱导炎性反应，扩大级联效应，造成细胞、脑组织的进一步损伤［16］。两者在脑出血急性期显著升高，并与病情严重程度呈正相关，能评价脑出血严重程度，参与预测急性脑出血的病情恶化［17-19］。

本研究中，中风1号方可不同程度降低不同时间段AICH模型大鼠Longa 5级评分、脑组织含水量、EB含量，72 h更明显，提示中风1号方可改善急性脑出血大鼠神经功能损伤、修复血脑屏障受损，减轻脑水肿。另外，本方亦可不同程度地显著降低脑出血周围组织24 h、72 h的TNF-α、IL-1β水平，提示中风1号方缓解急性脑出血的机制与抑制炎症因子水平密切相关。虽然中风1号方低、高剂量组对24 h大鼠神经功能、脑组织含水量的效果不存在明显差异，但有下降趋势，且中风1号方高剂量组对大鼠脑组织EB水平、TNF-α、IL-1β水平的效果比低剂量组更明显，存在剂量依赖性，这可能与给药疗程短等因素有关。药理研究结果提示，中风1号方中的中药单体大黄素可降低铁过载，抑制小胶质细胞激活，降低TNF-α、IL-1β、谷氨酸水平，减轻脑水肿，缓解脑出血［20-21］；牡丹皮通过升高大鼠血清超氧化物歧化酶含量、降低丙二醛、一氧化氮含量，减轻氧化应激、炎症反应［22］；三七总皂苷可降低脑出血大鼠TNF-α水平，保护损伤脑组织［23］；石菖蒲能减轻缺血脑中风模型大鼠脑水肿、保护脑细胞的作用与抑制脑皮质和海马神经细胞凋亡相关［24］。生地黄汤（含生地黄、大黄）可显著改善AICH模型大鼠神经功能，减轻脑水肿及EB外渗，其机制与下调TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β表达，抑制小胶质细胞活化有关［25］。有研究者采用差异mRNA表达结合网络药理学方法，发现周老所拟凉血通瘀方（含大黄、三七、生地黄、赤芍等）可通过干预AICH模型大鼠7个靶点，涉及5个病理通路来改善AICH，主要包括修复脑功能缺损，改善神经功能，保护血脑屏障损伤，减少炎症因子，抑制细胞凋亡［26］。他们的研究进一步佐证了凉血通瘀法的疗效，也为我们课题组进一步深入研究中风1号方的作用机制指引了方向。