杨剑锋，柯于鹤，雷 杰，田立群*

（1. 神农架林区中医医院，湖北 神农架 442421；2. 武汉市中西医结合医院，湖北 武汉 430022）

急性心梗发生后，临床上通过溶栓或冠脉介入等方法能够极大地恢复心肌灌注能力，减少心肌梗死面积，改善心功能，但同时因为血流恢复可能造成心肌缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury，I/R）。它主要表现为心肌持续缺血一段时间后再次恢复供血，而心肌的结构损伤和功能障碍加重。目前认为该过程的发生与氧自由基增加［1］、Ca2+超载［2］、代谢紊乱［3］等密切相关。最近研究人员进一步发现I/R 与心肌细胞凋亡密切相关［4-5］，当心肌细胞受损时，促凋亡物质如凋亡诱导因子、细胞色素C 等释放，会加速心肌细胞凋亡，故防止或减轻心肌细胞凋亡是防治I/R 的重要手段。

本课题组前期研究发现葱白提取物（fistular onion bulb，FOB）在心肌缺血再灌注过程中，能明显缩小大鼠I/R 心肌梗死面积，改善心功能，降低心肌细胞的凋亡率［6-7］。为进一步研究FOB在I/R 的保护机制，本课题拟构建I/R 大鼠模型，探讨FOB 对I/R 大鼠心肌组织的影响，并从p38 MAPK 信号通路研究对细胞凋亡的影响，为临床心肌缺血再灌注损伤的防治提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物 SD 雄性大鼠，SPF 级，36 只，体质量200 ～220g，购于湖北省实验动物研究中心，动物许可证号：SYXK（鄂）2017-0067。

1.1.2 药物 葱白提取物（武汉市第一医院提供，批号：20170326）。

1.1.3 试剂 大鼠p38、p-p38（磷酸化）、p53，β 微管蛋白（β-tubulin）抗体（武汉ABclonal 生物科技有限公司，批号分别为：A5521、AP0056、A0225），辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG 抗体（武汉ABclonal 生物科技有限公司，批号为：AS003），其余试剂均为市售分析纯。

1.1.4 仪器 117122004 型超净台（美国Thermo 公司），超低温冰箱（SANYO，日本），EG1150 组织包埋机（徕卡公司，德国），CM1520 组织切片机（Leica 公司，德国），DMi8 倒置显微镜（德国Leica 公司），5418R 型高速冷冻离心机（艾本德公司，德国），Mini-PROTEANTetra 型电泳槽，Mini-PROTEA 型转印槽，GelDoc XR 型凝胶成像系统（伯乐公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 大鼠适应性喂养1 周后，随机数字表法分为sham 组、I/R 组、FOB 组，每组12 只。

1.2.2 给药 sham 组与I/R 组按10 mL/kg 灌胃蒸馏水，FOB 组按600 mg/kg 灌胃给药，给药体积为2 mL/kg，每天1 次，连续14 d。

1.2.3 大鼠I/R 模型建立 参考文献［8］建立模型。大鼠用10%戊巴比妥钠，40 mg/kg 麻醉后，仰卧固定。气管切开人工呼吸机进行机械通气，呼吸频率为60 ～65 次/min。充分暴露心脏后，在冠状动脉左前降支以下约2 mm 处穿线，稳定10 min 后闭合胸腔，以心电图QRS 波加大，ST 抬高作为缺血成功的标准。结扎45 min 后松开结扎部位，实现再灌注过程。sham 组只穿线不结扎，其余操作同模型组。

1.2.4 心功能检测 造模后通过PowerLab 多导生理记录仪进行数据采集和分析左心室功能变化。主要指标如下：心率（HR）、左心室收缩压（LVSP）、左心室舒张末压（LVEDP）、左心室压力最大上升和下降速率（+dP/dtmax，-dP/dtmax）。

1.2.5 TUNEL 染色检测 给药结束后24 h，每组取6 只大鼠，以10%戊巴比妥钠，40 mg/kg 麻醉，采集结扎线以下心肌组织，生理盐水冲洗，10%甲醛固定，包埋，切片，抗原修复，脱蜡，漂洗。配制TUNEL 反应液，按照说明书操作；每只大鼠取3 张切片，每片镜下（40 × 10）取缺血区5 个视野，采用Image Pro Plus 6.0 记录，并计算细胞凋亡率。

1.2.6 Western Blot 检测p38 等蛋白表达 给药结束后24 h 采取心肌组织，使用心肌组织匀浆，随后4 ℃离心5 min（12 000g）取上清。取60 μg 样品进行15%聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，p38 抗体、p-p38（磷酸化）抗体、p53 抗体（稀释倍数1∶500）4 ℃孵育过夜，次日洗去一抗，TBST 洗膜3 次，每次10 min，加二抗（稀释倍数1∶1 000）室温孵育2 h，以β-tubulin 为内参对照，显影，拍片，Image J 软件分析。

1.2.7 RT-PCR 检测目的基因 使用给药结束后24 h 采取的心肌组织，Trizol 提取心肌总RNA，逆转录为cDNA，GAPDH 作为内参，分别扩增目的基因。反应体系20 μL，反应条件：95 ℃预变性90 s，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，共40 个循环；扩增反应结束由65 ℃升至95 ℃，采用2-△△CT相对定量法计算基因表达并统计分析。引物由谷歌生物科技有限公司设计并合成，引物序列见表1。

表1 各引物序列号Tab.1 Primer serial number

1.2.8 统计学方法 数据以均数± 标准差（±s）表示，SPSS 18.0 软件分析，单因素方差分析比较多组间的差异，并进行方差齐性检验，方差不齐以Tamhane′s T2检验。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FOB 预处理对各组心功能的影响

与sham 组比较，I/R 组LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax 均明显降低，LVEDP 值升高（P＜0.05，P＜0.01），提示心功能受损；与I/R 组比较，FOB 组LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax 值均升高，同时LVEDP 降低（P＜0.05），见表2。

表2 FOB 预处理对各组心功能的影响（xˉ± s），（n=12）Tab.2 Effect of FOB pretreatment on cardiac function of eachgroup（xˉ± s），（n=12）

2.2 FOB 对I/R 心肌细胞凋亡的影响

sham 组未见明显TUNEL 阳性表达。与sham 组相比，I/R 组心肌缺血区凋亡细胞指数增加（P＜0.01）；与I/R 组比较，FOB 组心肌细胞凋亡率明显下降（P＜0.01），见图1。

图1 各组TUNEL 染色比较Fig.1 Comparison of TUNEL staining in eachgroup

2.3 FOB 对I/R 心肌组织p38 等蛋白表达的影响

与sham 组比较，I/R 组梗死区域（AAR）p-p38、p53 蛋白表达量显著升高（P＜0.05），FOB处理后AAR 区p-p38、p-53 蛋白的表达有不同程度下降（P＜0.01）。梗死边缘区（BZ）及非梗死区（RA）区域未见明显差异，见图2。

图2 各组p38 MAPK 及磷酸化蛋白的表达比较Fig.2 Comparison of the expression of p38 MAPK and phosphorylated protein in eachgroup

2.4 FOB 对I/R 心肌组织p38、p53 mRNA 表达的影响

与sham 组比较，I/R 组p53 mRNA 相对表达水平显著升高（P＜0.05）；与I/R 组比较，经过FOB 处理后，p53 mRNA 相对表达水平显著下降（P＜0.05），p38 组间比较差异无统计学意义。见图3。

图3 各组p38、p53 mRNA 的表达水平比较Fig.3 Comparison of the expression levels of p38 and p53 mRNA in eachgroup

3 讨论

缺血性心脏病近年来在我国发病率逐渐增高，当心肌缺血时，能量供应和氧的运输都会减少，进而导致组织细胞发生损伤和死亡，尽早地进行再灌注治疗是降低心肌损伤的有效方法。但同时又面临的问题是心肌缺血缺氧会导致心肌损伤，心肌缺血缺氧恢复后又会进一步加重心肌损伤，严重者出现心律失常，梗死面积扩大等，即心肌I/R 损伤。因此，寻找治疗心肌I/R 损伤的药物是目前亟待解决的问题。中医药对于心血管疾病的治疗具有较长的历史，早在《金匮要略》中记载：“夫脉当取太过不及，阳微阴弦，即胸痹而痛。”指出辛温通阳法是治疗胸痹病的原则。葱白作为一种常见中药，具有鼓舞心脉，温通心阳的作用，现代研究也发现FOB 具有调节脂代谢、抗氧化、扩管、保护血管内皮细胞、减少细胞凋亡，发挥改善心肌缺血、减轻心肌缺血再灌注损伤的作用［9-10］。

心肌缺血再灌注损伤涉及多种因子的参与，其中p38 MAPK 信号通路发挥重要作用［11-12］。p38 MAPK 是一种脂多糖刺激白细胞分泌的磷酸化蛋白激酶［13］。它是胞内信号传递的枢纽，它的激活可以加速细胞凋亡的发生。心肌缺血再灌注发生后会产生大量氧自由基和细胞因子，它们的大量释放会激活p38 MAPK，并随之通过加重炎症及促进细胞凋亡；同时p38 MAPK 途径的激活促使转录因子和胞质蛋白质磷酸化，中性粒细胞和血小板活化增加，进一步加重了心肌缺血再灌注损伤［14-15］。而p53 蛋白是异常激活的p38 MAPK 通路下游重要的凋亡调控分子，当p38 MAPK 激活后可以直接诱导p53 的磷酸化，活化的p53 会迅速向线粒体转位，进而加速了细胞凋亡的进程［16-17］。这些研究提示，降低p38 MAPK 信号通路相关蛋白活性是缓解缺血再灌注损伤，改善心功能的重要方法。

本实验首先证实了I/R 模型制备后大鼠出现了明显心功能受损，提示心肌缺血导致的缺血再灌注损伤，通过FOB 预处理后心功能得以明显改善，同时本实验通过检测细胞凋亡率发现了FOB 预处理使心肌细胞凋亡率明显降低。为了进一步探讨其发生机制，本实验从分子水平研究了p38 磷酸化蛋白及p53 的表达，结果提示了p-p38、p53 在I/R 组明显升高，而通过FOB 预处理后p-p38、p53 蛋白表达显著下降，证实了p38 MAPK 参与了I/R 心肌细胞的凋亡过程。但p38 mRNA 表达未见显著性差异，可能是因为调控p38 蛋白表达存在多途径多靶点，具体的机制将是下一步研究的重点。

综上所述，FOB 对I/R 模型大鼠的心功能具有保护作用，其机制可能通过降低p38 MAPK 信号通路蛋白磷酸化水平、降低细胞凋亡率，从而达到保护心肌缺血再灌注损伤的作用。