周海, 潘凯, 陈玉明, 申余勇, 周明, 贺兴军, 费尚春, 王小祥

微小RNAs(mircoRNAs, miRNAs)是一种由21～22个核苷酸构成的非编码RNA,可以通过与靶基因3′-非编码区(untranslated region, UTR)结合影响转录后调控,从而抑制mRNA翻译或促进mRNA降解。实验证据表明miRNAs参与了多种肿瘤的发生、发展[1]。Sprouty2属于哺乳动物Sprouty信号转导蛋白家族,在细胞凋亡、增殖、迁移中发挥重要的作用[2-3]。本实验旨在研究miR-122在肾癌中的作用,并确定Sprouty2是否是miR-122的作用靶点。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 组织标本 原发性肾癌和相邻正常组织标本来自扬州大学附属医院2017年1月至2019年6月接受部分或根治性肾切除术的患者,共42例,中位年龄55岁(41～70岁)。组织标本于术后立即在液氮中冷冻,并储存在-80 ℃冰箱冻存备用。选取肿瘤组织>70%的样品用于提取总RNA。本研究方案经本院伦理委员会审核,并取得所有患者及家属书面知情同意。

1.1.2 实验材料 CAKI-1、786-0细胞系、放射免疫沉淀测定缓冲液(南京凯基生物公司),Lipofectamine 2000TM试剂、Trizol试剂(上海英俊生物公司),转染序列(上海吉玛公司),Sprouty2和 GAPDH基因序列(上海捷瑞生物),NanoDrop(Thermo Fisher Scientific公司,美国),TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒、TaqMan MicroRNA Assay Kit及 7900HT Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems公司,美国),PrimerScript One-Step RT-PCR试剂盒(大连Takara公司),PVDF膜(Millipore公司,美国),抗β微管蛋白、小鼠抗Sprouty2(Abcam公司,美国),化学发光试剂盒(Thermo Fisher Scientific公司,美国),细胞计数试剂盒-8(CCK-8)(上海碧云天生物技术公司),pGL3-REPORT荧光素酶载体试剂盒(Invitrogen公司,美国),双荧光素酶测定法(Promega公司,美国)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和转染 本实验使用了CAKI-1和786-0两种人类细胞系。细胞在包含有10%胎牛血清(FBS)、100 μg/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的RPMI-1640和McCoy’s 5A培养基中,于含有5%CO2的37 ℃环境培养。在转染前1天将细胞接种在6孔板上,细胞生长密度约70%时使用LipofectamineTM2000试剂进行转染。转……