黄秀容，袁 青，柳爱红，王兴旺，方宣琼

(1.深圳市人民医院，广东 深圳 518001; 2.广州中医药大学针灸康复临床医学院，广东 广州 510405)

脑卒中后抑郁症(Post stroke depression，PSD)是脑卒中患者经常出现的情感障碍性疾病，临床症状以悲观绝望、食欲下降、活动减少以及睡眠紊乱等为主，严重时会导致自杀，严重延缓患者康复，影响其生活质量，并可再次诱发卒中[1]。PSD作为脑卒中患者常见的并发症之一，脑内炎症及神经递质功能缺陷在其发病过程中发挥着重要作用，脑部缺血缺氧极易引发患者脑组织炎症损伤并造成神经功能障碍，从而诱发PSD[2-3]。单胺类神经递质水平与人类情感、认知功能密切相关，脑卒中可导致患者脑组织神经递质减少，进而引发抑郁、攻击性增强等情感障碍症状[4-5]。研究发现，miRNA-219水平与缺血性脑卒中患者梗死体积、炎症水平呈负相关，降低其水平可加剧脑组织炎症损伤[6]。miRNA-219可通过下调钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱγ(Calcium/calmodulin-dependent protein kinase kinase Ⅱγ，CaMKⅡγ)表达，改善临床使用氯胺酮诱发的精神分裂症[7]。另有研究发现，β-CaMKⅡ蛋白参与抑郁的发生发展，抑制其表达可明显改善抑郁大鼠临床症状[8]。根据以上研究推测miRNA-219/CaMKⅡγ信号可能是抑郁症的潜在治疗靶点。针刺特定穴位是临床治疗PSD的常用方法，具有简便、安全和经济等优点，针刺百会、印堂、神庭、风池、大椎及四神聪穴可抑制抑郁患者体内炎症，提高神经递质5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)水平，缓解其临床症状[9-10]，但针刺百会、印堂对脑卒中抑郁大鼠神经递质释放及miRNA-219/CaMKⅡγ通路的影响目前还不清楚。本研究通过建立PSD大鼠模型，对此进行探讨。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物 清洁级SD大鼠购自康美华大基因技术有限公司，动物生产许可证号：SYXK(粤)2019-0205，动物质量合格证号：00592317，雄性，体质量180～220 g。所有大鼠在本院动物房中适应饲养1周后进行实验，饲养条件：自然照明，温度25℃，相对湿度50%，大鼠自由饮食、饮水，保持动物房环境清洁、安静和通风良好。

1.1.2 主要试剂及仪器 文拉法辛(批号B33845)、蔗糖(批号B21647)购自上海源叶生物科技有限公司；NE(批号30189117)、DA 标准品(批号IR-44626)购自上海甄准生物科技有限公司；5-HT标准品(批号D1834)购自上海宝曼生物科技有限公司；兔源GAPDH一抗(批号ab181602)、兔源CaMKⅡγ一抗(批号ab79359)、羊抗兔二抗(批号ab150077)购自美国Abcam公司；RNAiso Plus试剂盒(批号9108)、逆转录试剂盒(批号RR037Q/A/B)、荧光定量PCR试剂盒(批号639519)购自日本Takara公司；蛋白裂解液(批号RIPA20110527)购自上海研谨生物科技有限公司；BCA试剂盒(批号P0011)、HE染色试剂盒(批号C0105)购自上海碧云天公司等。华佗牌针灸针(0.20 mm×15 mm)购自苏州医疗用品有限公司；敞箱(100 cm×100 cm×50 cm)购自北京友诚嘉业生物科技有限公司；Agilent1260液相色谱仪购自美国安捷伦公司；3900高通量DNA合成仪购自美国应用生物系统公司；CFX96 Touch Deep Well荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司；Mini PROTEAN蛋白电泳仪及转膜仪购自美国Bio-Rad公司；2500凝胶成像系统购自上海天能公司等。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型制备及分组给药 首先建立脑卒中大鼠模型，参照文献[11]，方法如下：采用2.5%戊巴比妥钠溶液(45 mg/kg腹腔注射)麻醉SD大鼠，颈部备皮、消毒后，经颈部解剖暴露右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)及颈内动脉(ICA)后进行钝性分离，取两根6-0丝线，其中一根结扎ECA、CCA远端，另一根穿过ICA松松地环绕1周，然后使用一根长40 mm、直径0.26 mm的尼龙单丝，将其光滑圆润的尖端通过CCA穿刺进入ICA，并经ICA进入大脑中动脉(MCA)，直到有轻微阻力，接着收紧环绕ICA的丝线，将尼龙线固定，防止出血，2 h后抽出尼龙线，按照Longa分级法[12]评价模型：0分，无明显神经功能缺损；1分，对侧前爪不能完全伸直；2分，大鼠向左侧盘旋；3分，大鼠向左侧坠落；4分，不能行走。评分为1～3分的大鼠采用慢性不可预见性温和应激刺激后孤养法[13-14]制备PSD模型，如下方法：禁食24 h、禁水24 h、以1 mA电流足底电击30 min(1次/min，每次持续1 s)、昼夜颠倒24 h、4℃冰水游泳5 min、水平振荡30 min(160次/min)、夹尾1 min，每天随机选取1种方法刺激大鼠，保证不连续出现同种刺激，持续3周，然后以单笼饲养大鼠16 d，测得大鼠蔗糖水消耗量降低，敞箱水平与垂直运动次数均降低，表明模型建立成功。共建模54只，成功48只，随机分为模型组、针刺组、非经非穴组和文拉法辛组，每组12只，另取12只大鼠进行同样的手术，不插入尼龙线，不做慢性不可预见性温和应激刺激，正常饲养并设定为假手术组。

依据《大鼠穴位图谱》及解剖学方法，针刺组大鼠选取百会、印堂穴，非经非穴组大鼠选取双侧前肢足背侧第3、4 跖骨间隙凹陷处[14]，采用0.20 mm×15 mm针灸针在大鼠清醒状态下针刺，进针深度2～3 mm，20 min行针1次，每次行针30 s，针刺40 min，每日针刺1次，持续4周。以生理盐水溶解文拉法辛配制为终浓度2 mg/kg的溶液，文拉法辛组大鼠以10 mL/kg的剂量进行灌胃[15]，假手术组和模型组大鼠以等剂量生理盐水灌胃，1次/d，持续4周。

1.2.2 大鼠神经功能损伤检测 治疗结束24 h后，参照Longa分级法[12]对各组大鼠神经功能缺损进行评分。

1.2.3 大鼠行为学检测及标本收集 神经功能损伤检测结束后，以蔗糖水消耗实验及敞箱实验检测大鼠行为学变化，蔗糖水消耗实验：将大鼠禁食禁水24 h，然后给予10 g/L蔗糖水，让其自由饮用，24 h后计算糖水消耗量，公式为：蔗糖水消耗量=蔗糖水消耗量/蔗糖水总量×100%；敞箱实验：大鼠置于敞箱正中，以大鼠三足跨入邻格为水平运动1次，以大鼠双足离开底面直立为垂直运动1次，测定5 min内大鼠水平运动与垂直运动次数。

行为学检测结束后，麻醉大鼠后处死，迅速解剖分离大脑，获得脑组织，剪取约1.5 g储存在-80℃冰箱备用。

1.2.4 高效液相色谱法测定大鼠脑组织NE、5-HT及DA含量 取脑组织约0.5 g剪碎后，置于蛋白裂解液中混匀，以匀浆机制备为匀浆液，离心后收集上清，置于4℃冰箱中解冻，以高效液相色谱仪测定其中NE、5-HT及DA水平，具体操作参照说明书进行。

1.2.5 qRT-PCR检测大鼠脑组织miRNA-219及CaMKⅡγ mRNA水平 取脑组织0.5 g剪碎后，置于RNAiso Plus混匀，参照其说明书的操作步骤提取总RNA，接着采用逆转录试剂盒及荧光定量PCR试剂盒将其逆转录为cDNA后进行荧光定量PCR反应，参照试剂盒各自的说明书进行反应体系的配制、反应条件的设定，使用U6为miR-219的内参，GADPH为CaMKⅡγ的内参，以2-ΔΔCt算法计算分析所得实验数据，进而得到各组样品中miRNA-219及CaMKⅡγ mRNA相对表达量。miR-219、U6、CaMKⅡγ和GAPDH引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。各基因引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.6 蛋白免疫印迹法检测各组大鼠脑组织CaMKⅡγ蛋白表达 冰箱备用脑组织中剩余脑组织剪碎后，置于蛋白裂解液中混匀，以匀浆机制备匀浆液，离心后取上清获得总蛋白样品液，以BCA试剂盒测量其中蛋白总浓度，具体操作步骤参照说明书进行，然后根据结果调整各组样品，使总蛋白浓度相同，煮沸5 min后变性，各组取相同体积的样品液上样进行电泳，蛋白分离后将其转移至PVDF膜上，使用5%脱脂奶粉溶液于室温下进行封闭，根据蛋白分子量截取目的蛋白条带，将其置于分别含有兔源GAPDH、CaMKⅡγ一抗的孵育盒中，于4℃冰箱中孵育过夜，以TBST漂洗后加入羊抗兔二抗，置于摇床上室温孵育2 h，以TBST再次漂洗后采用增强化学发光法显色，采用凝胶成像系统拍摄蛋白条带，并以Quantity One软件对其进行分析，得到各组蛋白相对表达量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠神经功能比较

与假手术组比较，模型组大鼠神经功能缺损评分明显升高(P<0.05)。与模型组相比，文拉法辛组、针刺组大鼠神经功能缺损评分降低(P<0.05)；非经非穴组大鼠神经功能缺损评分差异无统计学意义(P>0.05)。针刺组与文拉法辛组比较，大鼠神经功能缺损评分差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

注：A.假手术组；B.模型组；C.非经非穴组；D.针刺组；E.文拉法辛组。与假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05。图1 各组大鼠神经功能缺损评分比较

2.2 各组大鼠行为学比较

与假手术组比较，模型组大鼠蔗糖水消耗量、水平运动与垂直运动次数明显降低(P<0.05)。与模型组相比，文拉法辛组、针刺组大鼠蔗糖水消耗量、水平运动与垂直运动次数升高(P<0.05);非经非穴组大鼠蔗糖水消耗量、水平运动与垂直运动次数差异无统计学意义(P>0.05)。针刺组与文拉法辛组比较，大鼠蔗糖水消耗量、水平运动与垂直运动次数差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠蔗糖水消耗量、水平运动与垂直运动次数比较

2.3 各组大鼠脑组织中神经递质NE、5-HT和DA含量比较

与假手术组比较，模型组大鼠脑组织中神经递质NE、5-HT和DA含量明显降低(P<0.05)。与模型组比较，文拉法辛组、针刺组大鼠脑组织中神经递质NE、5-HT和DA含量升高(P<0.05);非经非穴组大鼠脑组织中神经递质NE、5-HT和DA含量差异无统计学意义(P>0.05)。针刺组与文拉法辛组比较，大鼠脑组织中神经递质NE、5-HT和DA含量差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 各组大鼠脑组织神经递质NE、5-HT和DA含量

2.4 各组大鼠脑组织miRNA-219、CaMKⅡγ mRNA水平比较

与假手术组相比，模型组大鼠脑组织中miRNA-219明显降低(P<0.05)，CaMKⅡγ mRNA表达明显升高(P<0.05)。与模型组相比，文拉法辛组、针刺组大鼠脑组织中miRNA-219升高(P<0.05)，CaMKⅡγ mRNA表达降低(P<0.05);非经非穴组大鼠脑组织中miRNA-219、CaMKⅡγ mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。针刺组与文拉法辛组比较，大鼠脑组织中miRNA-219、CaMKⅡγ mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 各组大鼠脑组织miRNA-219、CaMKⅡγ mRNA相对表达水平

2.5 各组大鼠脑组织中CaMKⅡγ蛋白表达比较

与假手术组相比，模型组大鼠脑组织中CaMKⅡγ蛋白表达明显升高(P<0.05)。与模型组相比，文拉法辛组、针刺组大鼠脑组织中CaMKⅡγ蛋白表达降低(P<0.05);非经非穴组大鼠脑组织中CaMKⅡγ蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。针刺组与文拉法辛组比较，大鼠脑组织中CaMKⅡγ蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图2、图3。

图2 免疫印迹检测各组大鼠脑组织中CaMKⅡγ蛋白表达

注：A.假手术组；B.模型组；C.非经非穴组；D.针刺组；E.文拉法辛组。与假手术组相比，aP<0.05；与模型组相比，bP<0.05。图3 各组大鼠脑组织中CaMKⅡγ蛋白表达比较

3 讨论

本研究以大脑中动脉线栓阻塞法建立脑卒中模型大鼠后，采用慢性不可预见性温和应激刺激后孤养法制备PSD大鼠模型。结果显示，模型大鼠神经功能缺损评分明显升高，表明建模大鼠神经功能明显受损。蔗糖水消耗实验可检测大鼠快感缺乏程度，旷场实验可测定大鼠的自主活动及探索行为强度，两者均是判定抑郁症状严重程度的常用实验手段[16]，单胺类神经递质去甲肾上腺素(Norepinephrine，NE)、多巴胺(Dopamine，DA)和5-HT在人类情感、认知功能的正常维持中起到关键作用，脑组织中含量降低可引发患者抑郁[5]。本研究发现，与假手术组比较，模型大鼠蔗糖水消耗量、水平运动与垂直运动次数、神经递质NE及5-HT、DA含量均明显降低，表明以慢性不可预见性温和应激刺激后孤养法处理脑卒中大鼠可导致其快感缺乏，兴趣及自主活动降低，神经传导功能受损，引发抑郁，揭示PSD大鼠模型建立成功。

PSD的临床治疗主要分为药物疗法和非药物疗法，非药物疗法包括针刺治疗、经颅直流电刺激、心理疏导和高压氧治疗等，其中针刺疗法因简便有效、经济安全等优点而广泛应用于临床，近年来因穴位选择的不同，使得其治疗方法越来越丰富多样。中医学认为，PSD属于郁证，因内伤七情造成，气机紊乱、脑失所养、神机不运是其主要病机，印堂为经外奇穴，以针刺之具有镇静安神的功效，百会穴属于督脉经穴，以针刺之可调控人体阴阳平衡、改善精神异常[17-18]。本研究结果显示，针刺百会、印堂穴可降低模型大鼠神经功能缺损评分，升高蔗糖水消耗量、水平运动与垂直运动次数，表明经百会、印堂穴进行针刺治疗可修复PSD大鼠神经功能障碍，提高大鼠快感、兴趣及活动度，进而改善抑郁症状，进一步证实针刺对PSD具有一定疗效。

PSD发病机制复杂，脑损伤、神经递质、炎症、基因多态性与社会因素等均是其致病因素，其中脑内炎症导致的脑组织变性坏死，脑部单胺类神经递质NE、5-HT和DA缺乏造成的神经传导功能缺陷是PSD发生发展的重要诱因[5,19]。miRNA-219作为脑内广泛分布的内源性非编码小RNA，可与CaMKⅡγ mRNA结合抑制其蛋白表达，参与调控突触发生、神经发育和神经元凋亡等过程，与精神分裂症、抑郁等神经疾病的发生发展密切相关[6-8]。研究显示，抑郁症患者外周血miRNA-219表达水平降低、CaMKⅡγ mRNA表达水平升高，提示miRNA-219/CaMKⅡγ信号通路可能是治疗抑郁症的作用靶点之一，但目前针刺百会、印堂穴是否对PSD大鼠神经递质释放及miRNA-219/CaMK Ⅱγ通路有影响还未见研究[20]。本研究对此进行探讨，结果显示针刺百会、印堂穴后，PSD大鼠脑组织中神经递质NE及5-HT、DA含量、脑组织miRNA-219表达升高，CaMKⅡγ mRNA及蛋白表达降低，表明针刺百会、印堂穴可增强PSD大鼠神经传导功能、上调miRNA-219表达、下调CaMKⅡγ表达，可能与促进神经功能修复、改善抑郁症状有关。

综上所述，针刺百会、印堂穴可抑制miRNA-219表达、促使CaMKⅡγ表达，促进脑卒中大鼠脑部神经递质释放，促进神经功能修复并改善抑郁症状，调控miRNA-219/CaMKⅡγ信号通路可能是其作用机制之一，为临床PSD的治疗提供了新思路，因本研究只对其分子机制进行了初步研究，未上调或抑制miR-219表达来进行对照验证，故存在一定不足，有待后续进行深入探讨。