杜高波，唐其柱

(武汉大学人民医院心内科，武汉大学心血管病研究所，心血管病湖北省重点实验室，武汉430060)

心肌重构是指在各种病理生理因素刺激下，心脏结构、形态和功能发生的适应性代偿改变的现象，是心力衰竭发生发展过程中的重要病理改变[1]。心肌重构主要包括结构重构和电重构，以心肌间质纤维化、心肌细胞肥大、心室顺应性降低和心室电传导异常为主要特征，可直接影响心脏功能甚至导致死亡[2,3]。因此，以心肌重构为靶点防治心力衰竭具有重要意义和前景。罗氟司特(roflumilast，RM)是第1个被美国食品和药物管理局批准上市的磷酸二酯酶4(phosphodiesterase 4，PDF4)抑制剂，主要用于慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)的治疗，具有良好的抗炎特性及器官保护作用[4]。在细菌诱导的COPD小鼠模型中，RM能够显著抑制肺内白细胞浸润、支气管壁重构及肺气肿[5]。此外，RM还能够降低COPD患者血清中促炎症细胞因子的水平。最近的一项研究表明，RM可通过抑制p38丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路改善脓毒症肝损伤，提高小鼠生存率[6]。而在心脏中，p38 MAPK信号通路及炎症反应的激活是导致心肌重构的重要机制[7,8]。基于此，我们认为RM可能通过调节小鼠心肌中p38 MAPK信号及炎症反应改善压力负荷诱导的心肌重构。本研究通过主动脉缩窄术(aortic banding，AB)构建小鼠心肌重构模型，观察RM对小鼠心肌重构及心功能的影响，同时探讨了RM影响小鼠心肌重构的潜在机制，旨在为今后心肌重构及心力衰竭的药物治疗提供一定的参考依据。

国家为自贸区的建立出台了一系列政策，也为自贸区知识产权保护制度的构建提供了便利。国务院于2013年在《中共中央关于全面深化改革若干重大问题的决定》中指出，国家应通过更为成熟的手段，加强和运用健全的知识产权保护制度，完善技术创新的激励机制，并努力探索建立健全专门知识产权法院；国家对知识产权的保护日益重视，在知识产权核心法律体系中，法定赔偿额的提高以及相关的顶层制度设计与出台均反映了中央对知识产权的重视程度。重庆自贸区作为我国西部自贸区的试验基地，其地位显得尤为重要，因为先行试验基地的成功与知识产权保护有着密切的关联，同时知识产权的保护也为以后的自由贸易区提供着重要借鉴。

1 材料与方法

1.1 试验材料

RM购自于美国Sigma公司，纯度≥98%；CD45和CD68抗体购自于美国Abcam公司；总p38(total-p38，T-p38)、磷酸化的p38(phosphorylated-p38，P-p38)及GAPDH抗体均购自于美国Cell Signaling Technology公司；免疫组织化学DAB试剂盒购于美国Gene-tech公司；羊抗兔IgG抗体购自于美国LICOR公司。

如SiO2/Fe3O4-C颗粒和Fe3O4-C磁性空心微球的磁滞回线，如图2(d)所示，2种样品均表现出典型的超顺磁性。SiO2/Fe3O4-C颗粒的磁饱和强度为17.1 emu/g，除去中间的硅胶核心后，最终的Fe3O4-C空心微球的磁饱和强度上升至42.5 emu/g，完全满足磁分离的需要。图2(d)内部的小图显示的是Fe3O4-C空心微球在水溶液中的分散情况(左)和磁分离效果(右)，显示了材料在无外加磁场时良好的分散性和施加外加磁场时良好的磁响应性，这对于材料的实际应用非常重要[10]。

1.2 实验动物及模型建立

雄性C57/B6小鼠(8～10周)，体质量 255～320 g，购自于中国医学科学院实验动物研究所(动物合格证号：11401300036042)，饲养于武汉大学心血管病研究所动物中心。采用随机数表法随机将40只小鼠随机分为假手术组(Sham组)，AB组，AB+RM(1mg/kg)组及AB+RM(3 mg/kg)组，每组10只。AB组，AB+RM(1 mg/kg)组及AB+RM(3 mg/kg)组小鼠均接受AB手术处理。超声心动图检测术后6周是否成功建立压力负荷诱导的心肌重构模型。AB+RM(1 mg/kg)组及AB+RM(3 mg/kg)组小鼠于AB术后2 d开始，每天给予1及3 mg/kg的RM灌胃处理，持续6周。本研究中所有涉及动物的实验均通过武汉大学动物护理和使用委员会批准。

1.3 AB组小鼠手术方法

首先将各组石蜡切片于60 ℃温箱中脱蜡30 min，采用柠檬酸盐高压法进行抗原修复；随后将3%双氧水覆盖于心肌组织上孵育15 min， 8%羊血清封闭30 min，一抗CD45和CD68(1∶200，磷酸缓冲液稀释)滴加并完全覆盖于心肌组织孵育，4 ℃过夜。次日，各组切片复温后滴加二抗B液，室温孵育30 min，冲洗后滴加显色剂二氨基联苯胺(Diaminobenzine, DAB)工作液，并在光镜下严格控制显色时间。最后，苏木素复染各组切片，梯度乙醇脱水后封片。随机选取10张心肌组织不重复的区域观察，记录视野中白细胞及巨噬细胞数量。

目前，高中生物一线教师在培育学生生命观念的教学过程中存在一定的问题。例如，教师对生命观念的内涵缺少深刻的理解、对生命观念在生物学中相应的锚定点缺少系统的把握、对三维目标和核心素养教学目标的转化缺少足够的认识、对培育学生生命观念的系统教学方案缺少应有的重视等。下面重点阐述生命观念及其培育策略。

1.4 各组小鼠心脏形态学参数的收集

各组小鼠通过吸入1.5%异氟烷麻醉后，剔去心前区毛发，固定于保温平板上，采用MyLab 30CV多普勒超声诊断仪(意大利Biosound Esaote公司，频率10 MHz)检测。在靠近乳头肌水平的胸骨旁长轴和胸骨旁短轴上以二维模式成像后，记录一个二维引导的穿过左心室前壁和后壁M型超声，随后收集并计算心脏的形态学参数，心率(heart rate，HR)、左室短轴缩短率(left ventricular fraction shortening，LVFS)、左室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)、左室收缩末期内径(left ventricular end-systolic diameter，LVESD)及左室舒张末期内径(left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD)。各参数最终取值为3个连续心动周期的平均值。

1.5 心肌肥厚与纤维化的形态学检测

1.6.1 RNA的提取 各组取30 mg心肌组织剪碎并加入TRIzol，充分研磨后离心取上清液，加入200 ml三氯甲烷，静置5 min。12 000 g离心15 min(4 ℃)，取上清液转移至新的离心管，加入等体积异丙醇，静置10 min。再次12 000 g离心30 min(4 ℃)，得到白色沉淀。75%乙醇进行漂洗，继续7 500 g离心5 min(4 ℃)。利用紫外分光光度计检测所获RNA的浓度及纯度，当A260/A280=1.8～2.0时，代表该样品达标可用。

1.6 qPCR检测肥厚、纤维化及炎症相关基因

通过颈椎脱臼法处死各组小鼠后，获取小鼠心脏，用吸水纸擦干心脏残余液体，并称重(mg)，获得心重/体重(heart weight/body weight，HW/BW)值。同时取出小鼠下肢胫骨并测量其长度(cm)，计算心重/胫骨长(heart weight/ tibia length，HW/TL)。随后，迅速将心脏置于有10%甲醛溶液的容器中固定，随后进行石蜡包埋并制成厚度为5 μm的切片。HE染色评价心肌组织形态结构，天狼猩红染色评价心肌组织间质及血管周纤维化状况。用Image-ProPlus 6.0软件分析计算各组心肌细胞横截面积及心肌组织中胶原百分比。

为了更好地落实新型职业农民培育工程，需要围绕市场需求，合理地设计新型职业农民培育工程信息管理系统。同时，结合实际确定新型职业农民培训工程实操计划，旨在提高新型职业农民的培育质量。

超声心动图数据显示(图1A)，与Sham组相比，AB组小鼠心室壁厚度明显增加；与AB组相比，AB+RM(1 mg/kg)组及AB+RM(3 mg/kg)组小鼠心室壁厚度明显减少；进一步分析发现，4组小鼠HR无明显差异(P>0.05)，表明心功能各指标具有可比性(图1B)。与Sham组相比，AB组小鼠EF和FS百分数均显著降低(均P<0.05)，而LVESD及LVEDD则显著升高(均P<0.05)，表明AB手术成功诱导了小鼠心功能不全；与AB组小鼠相比，AB+RM(1 mg/kg)组及AB+RM(3 mg/kg)组小鼠EF及FS显著升高(均P<0.05)，而LVESD及LVEDD则显著降低(均P<0.05)，提示RM能够改善AB诱导的小鼠心功能不全(图1C～F)。

1.6.3 实时荧光定量PCR 将步骤1.6.2中获取的cDNA加60 μl DEPC水稀释后，配置反应体系。具体如下：(1)SyBr Green 10 μl；(2)DEPC水：8 μl；(3)正向引物及反向引物各0.5 μl。最终以GAPDH作为内参基因进行校正。各待测基因引物详见表1。

表1 qPCR引物序列Table 1 Primers used in qPCR

1.7 免疫组织化学法检测CD45和CD68

经腹腔注射的方式给予小鼠3%异戊巴比妥麻醉，同时经口给予气管插管辅助呼吸。在小鼠胸部2～3肋间隙水平方向切开皮肤，仔细分离降主动脉，将26号针置于主动脉旁并结扎。结扎后迅速拔出针头，逐层缝合小鼠肌肉及皮肤。

1.8 蛋白免疫印迹法检测

1.9 统计学处理

取约30 g的心肌组织用剪刀尽量剪碎，随后加入放射免疫沉淀试验裂解液，于研磨仪中充分粉碎。进一步超声(400 W，5 kHz)裂解后离心取上清液，二喹啉甲酸法测定蛋白浓度后，将各组蛋白液定容至等浓度。将所获蛋白用12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel，SDS-PAGE)电泳分离，随后转入聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，加入磷酸缓冲液稀释的P-p38(1∶500)，T-p38(1∶5000)及GAPDH(1∶1000)抗体，4 ℃孵育过夜，次日将PVDF膜置于羊抗兔二抗中避光孵育60 min，利用Odysse扫描仪(美国LI-COR)对各组蛋白条带扫描并定量，最终以GAPDH作为内参蛋白进行校正。

2 结果

2.1 4组小鼠心功能的比较

1.6.2 AMV逆转录 取0.65 ml EP管，加入4.5 μl DEPC水，1 μl引物及1 μl模板RNA。离心并沸水浴后加入0.5 μl dNTP，2 μl 5× Buffer及1μl AMV逆转录酶，离心后进行逆转录，获取cDNA。

基于先前的工作[25]，本文认为,判断弹体是否进入销蚀侵彻状态的主要依据为长杆弹头部是否形成了稳定的蘑菇头。由式(11)和式(12)可以看出，长杆弹形成稳定蘑菇头，且销蚀碎片抛射出的条件为

图1 各组小鼠心功能状况Figure 1 Heart function of mice among four groupsAB: aortic banding; RM: roflumilast; HR: heart rate; LVEF: left ventricular ejection fraction; LVFS: left ventricular fraction shortening; LVESD: left ventricular end-systolic diameter; LVEDD： left ventricular end-diastolic diameter. Compared with sham group,*P<0.05; compared with AB group, #P<0.05.

2.2 4组小鼠心肌肥厚相关指标的比较

HE染色结果显示，与Sham组相比，AB组小鼠心脏大体横截面积及心肌细胞横截面积均明显增加，HW/BW及HW/TL值明显上升(均P<0.05)；与AB组相比，AB+RM(1 mg/kg)组及AB+RM(3 mg/kg)组小鼠心脏大体横截面积及心肌细胞横截面积显著降低，同时HW/BW及HW/TL值也明显下降(均P<0.05；图2A～D)。进一步，我们分析了4组小鼠心肌肥厚相关标志基因[心钠素(atriopeptin，ANP)、脑利钠肽(brainnatriureticpeptide，BNP)及β-MHC]的mRNA表达水平，结果显示1和3 mg/kg的RM干预能够显著抑制AB诱导的小鼠心肌ANP、BNP及β-MHC的mRNA表达上调(均P<0.05；图2E～G)。

图2 4组小鼠心肌肥厚相关指标的比较Figure 2 Comparison of hypertrophic markers of mice among four groupsAB: aortic banding; RM: roflumilast; HW: heart weight; BW: body weight；TL: tibia length; ANP: atriopeptin; BNP: brain natriuretic peptide. Compared with sham group, *P<0.05; compared with AB group, #P<0.05.

2.3 4组小鼠心肌纤维化相关指标的比较

免疫组织化学染色结果提示，与Sham组相比，AB组小鼠心肌组织中CD45及CD68阳性细胞数目明显增多，同时增加促炎症细胞因子白细胞介素(interleukin-6,IL-6)及肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)的表达，表明AB能够通过促进心肌组织中白细胞及巨噬细胞浸润，激活心肌炎症反应(均P<0.05)；而不同剂量RM干预后均能降低心肌组织中炎症细胞数目，抑制相关促炎症细胞因子释放(均P<0.05；图4A～E)。免疫印迹结果揭示，与AB组相比，AB+RM(1 mg/kg)组及AB+RM(3 mg/kg)组小鼠心肌组织中p38蛋白磷酸化水平明显被抑制(均P<0.05；图4F, G)。

图3 4组小鼠心肌纤维化相关指标的比较Figure 3 Comparison of fibrotic markers of mice among four groupsAB: aortic banding; RM: roflumilast; Ctgf：connective tissue growth factor. Compared with sham group,*P<0.05; compared with AB group, #P<0.05.

2.4 4组小鼠心肌组织炎症反应及p38 MAPK的激活状态

天狼猩红染色结果显示，与Sham组相比，AB组小鼠心肌间质及血管周胶原沉积明显增加；与AB组相比，AB+RM(1 mg/kg)组及AB+RM(3 mg/kg)组小鼠心肌血管周及间质中胶原沉积明显降低(均P<0.05；图3A～C)；同时，我们分析了心肌纤维化相关标志基因(Ctgf、fibronectin、collagen1和collagen3)的mRNA表达水平，结果显示，与AB组相比，AB+RM(1 mg/kg)组及AB+RM(3 mg/kg)组小鼠心肌组织中Ctgf、fibronectin、collagen1和collagen3的mRNA表达水平明显降低(均P<0.05；图3D～G)。

图4 4组小鼠炎症反应及p38 MAPK信号的激活状况Figure 4 Inflammatory response and activation of p38 MAPK signaling pathway of mice among four groupsAB: aortic banding: RM: roflumilast; IL-6：interleukin-6；TNF-α：tumor necrosis factor-α; P-p38: phosphorylated-p38; T-p38: total-p38. Compared with sham group,*P<0.05; compared with AB group, #P<0.05.

3 讨 论

心肌重构是心脏应对各种内源性及外源性损伤时的一种适应性反应。一方面，长期压力负荷刺激下，白细胞向心脏浸润，与巨噬细胞、T淋巴细胞和心脏成纤维细胞相互作用，导致心肌组织中促炎和抗炎因子的平衡失调，同时促进心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，分泌大量细胞外基质，最终导致心肌胶原沉积和心脏纤维化[9]；另一方面，p38 MAPK信号通路作为关键的胞内信号转导交汇点，可介导多条信号通路导致心肌细胞肥大[10]。因此，抑制心肌组织炎症激活，阻断p38 MAPK信号通路对干预心肌重构、治疗心力衰竭具有重要意义。本研究发现新型抗COPD药物能够显著抑制压力负荷诱导的小鼠心肌肥厚及纤维化，可能与RM对心脏炎症激活的抑制剂p38磷酸化激活有关。

左心室功能障碍和心力衰竭与促炎细胞因子、T细胞、白细胞及巨噬细胞浸润密切相关。大量促炎症细胞因子的累积不仅会导致心脏各类细胞死亡、阻断β-肾上腺素信号、胚胎基因的激活、内皮细胞功能紊乱及胶原沉积，还能够通过激活下游的p38 MAPK信号通路、细胞外信号调节激酶及核因子-κb信号促进心肌肥厚。同时，炎症急性期促炎症细胞因子基因表达的增加可进一步通过自分泌和旁分泌的方式引起“继发性炎症反应”[11,12]。临床研究表明，心力衰竭患者外周血中促炎症细胞因子水平与心力衰竭严重程度呈正相关[13]。动物实验表明，心脏特异性过表达TNF-α能诱导小鼠发生自发性扩张型心肌病及心肌纤维化[14]。此外，心脏特异性过表达IL-1β能导致小鼠发生射血分数保留的心肌肥厚[15]。此外，抗炎症细胞因子IL-10能够通过抑制STAT3依赖的核因子-κb信号明显逆转压力负荷诱导的小鼠心肌重构[16]。上述研究提示抑制心肌炎症激活是预防心肌重构的重要靶点。

p38 MAPK隶属于MAPK家族，与多种心血管疾病(高血压、心肌梗死及心力衰竭等)的发生发展密切相关，可被缺血缺氧、紫外线、高糖、高渗、脂多糖、氧化应激及炎症等多种损伤相关刺激激活。心肌细胞在受到上述刺激后，会产生大量活性氧自由基，通过进一步激活p38 MAPK在内的相关促肥厚信号通路，诱导心肌细胞c-fos大量转录，最终导致心肌细胞体积增大[7]。同时，p38 MAPK信号亦可调节心脏成纤维细胞，影响心肌纤维化。体内实验表明p38 MAPK特异性抑制剂PH797804能够明显提高缺氧或肺动脉缩窄所诱导的小鼠右心室重构，改善心功能。体外实验进一步揭示PH797804可抑制TGF-β诱导的心脏成纤维细胞胶原合成及应力纤维形成，其机制可能与p38 MAPK对Smad2/3磷酸化及心肌素蛋白核转位的调节有关[17]。

(3)在铀尾矿下游农田中，除Cd和U，其余几种重金属潜在生态危害单项系数均小于6，潜在危害性很低，并不能对当地农田构成生态威胁。Cd单项系数均值为206.68，潜在生态危害程度为重。其次为U，单项系数均值为63.18，潜在生态危害程度为中。9个样品中有8个样品的RI值介于150～300之间，综合潜在生态风险程度为中，一个样品RI值超过300，综合潜在生态风险程度为重。总体来看，该农田潜在生态风险较高，主要是Cd和U所带来的潜在生态风险。

RM作为新型抗COPD的选择性PDF4抑制剂，在改善COPD患者肺功能及减少急性加重频率方面取得了良好效果。最近的研究表明，RM还能通过抑制炎症及p38信号通路改善脓毒症诱导的小鼠肝损伤[6]。此外，RM可通过下调iNOS，上调cAMP减轻溃疡性结肠炎大鼠的炎症反应[18]。本研究发现RM可显著改善压力负荷诱导的小鼠心功能不全，减轻心肌肥厚及纤维化。进一步实验发现，RM的抗心肌重构作用可能与对炎症反应及p38磷酸化的抑制有关。研究已证实，p38 MAPK亦是介导心肌细胞炎症和凋亡的重要原因之一[19]，因此本研究中RM抑制心脏炎症是否依赖于其对p38 MAPK信号通路的阻断还需要进一步的实验来阐明。

综上，RM可通过抑制心肌组织炎症细胞浸润及p39 MAPK信号激活改善压力负荷诱导的心肌重构，但仍需要进一步研究探讨其具体分子靶点。