龚美亮，邹琳，刘云霞

(解放军总医院第二医学中心：1检验科，2保健科，北京 100853)

铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa，PA)为医院常见条件致病菌，常分离自患者的痰液、尿液、血液、脑脊液以及其他分泌物中，是导致感染性疾病的重要因素。铜绿假单胞菌耐药机制复杂，包括天然耐药及获得性耐药。随着广谱抗生素的广泛应用，多重耐药铜绿假单胞菌(multidrug resistantpseudomonasaeruginosa，MDRPA)的检出率逐年攀升，如何针对这些MDRPA所致感染进行有效治疗，已成为广大医务工作者面临的棘手问题。老年患者作为一个特殊群体，具有气管切开及管路留置率高、基础疾病多、免疫力低下及反复住院率高的特点，这些会增加老年患者感染PA的风险，且有研究表明假单胞菌在老年病房内检出率占首位[1,2]。本研究对老年病房分离的MDRPA 菌株进行体外联合药物敏感试验，以期为临床合理用药提供科学依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2015年1月至2016年12月解放军总医院老年病房分离的MDRPA共58株。对同一患者相同部位分离的菌株不重复计算，所有菌株均经VITEK-2 Cpmpact全自动微生物鉴定药敏分析系统鉴定。MDRPA是指对三类或三类以上抗菌药物中的每一类抗菌药物至少一种药物获得性不敏感的PA[3]。患者年龄81～96(88.52±3.65)岁。质控菌株铜绿假单胞菌ATCC27853，大肠埃希菌ATCC35218，大肠埃希菌ATCC25922。

1.2 仪器及试剂

恒温培养箱、低温冰箱(赛默飞世尔，美国)；比浊仪(生物梅里埃，法国里昂)；电子天平(赛多利斯，德国)；无菌96孔平板(康宁公司，纽约)；无菌瓶(浙江拱东医疗科技有限公司，台州)；半自动多点接种仪(佐久间制作所，日本)；MH琼脂干粉(赛默飞世尔，美国)；一次性使用培养皿(金典生化器材有限公司，青岛)；美罗培南(meropenem，MEM)、环丙沙星(ciprofloxacin，CIP)及头孢吡肟(cefepime,FEP)标准品(中国食品药品检定研究院，北京)。

1.3 菌悬液配置

菌株分纯并37 ℃过夜培养，从MH 琼脂平板上挑取3～5个菌落，在灭菌生理盐水中制作菌悬液。菌液用比浊仪校正至0.5 MacFarland。

1.4 琼脂平板稀释法

将FEP、MEM及CIP分别倍比稀释成12个浓度值，三种药物浓度均为2560、1280、640、320、160、80、40、20、10、5、2.5、1.25 μg/ml。其中FEP稀释液为磷酸盐缓冲液，pH 6.0，0.1 mol/L；MEM和CIP稀释液均为无菌水。

单药平板制备：每个浓度抗生素溶液取2 ml加入18 ml MH琼脂溶液(约50 ℃)。联合抗生素平板制备：将FEP分别与MEM及CIP按棋盘法设计两两组合加入无菌瓶中，每种抗菌药物1 ml，再将联合药物加入融化并冷至50 ℃左右的18 ml MH琼脂中制成药平板。将配置好的菌液取200 μl加入96孔板中，用半自动多点接种仪接种至药平板。37 ℃过夜培养。观察指标，记录单独应用各药的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)，包括MIC甲药单用和MIC 乙药单用，并选择最佳组合效应两药联用时各自MIC(MIC甲药联用和MIC乙药联用)，以计算分级抑菌浓度(fractional inhibitory concentration, FIC)指数。

1.5 FIC 指数计算和判读标准[4]

FIC 指数=MIC 甲药联用/MIC 甲药单用+MIC 乙药联用/MIC 乙药单用。FIC 指数≤0.5，协同作用；0.52.0，拮抗作用。

2 结果

2.1 药物联用前后对MDRPA 的MIC 比较

FEP与MEM联用后，FEP的MIC50与MIC90均为单药的1/4；MEM的MIC50为单药的1/2，MIC90为单药的1/4。FEP与CIP联用后，FEP的MIC50与MIC90均为单药的1/2；CIP的MIC50与MIC90均为单药的1/4；表明各药物组合联用后有联合效应。详见表1。

表1 头孢吡肟与美罗培南及环丙沙星单用及联用对MDRPA 的MICTable 1 MIC of FEP，MEM，CIP alone or combined for MDRPA (n=58, μg/ml)

2.2 浓度-累积抑菌率曲线

FEP与MEM，CIP联用后，三种药物的浓度-累积抑菌率曲线均表现为左移，表明联用药物组合具有联合效应(图1，2)。

图1 头孢吡肟与美罗培南联用的浓度-累积抑菌率曲线Figure 1 Concentration-accumulative inhibition rate curves for FEP combined with MEMFEP：cefepime；MEM：meropenem.

图2 头孢吡肟与环丙沙星联用的浓度-累积抑菌率曲线Figure 2 Concentration-accumulative inhibition rate curves for FEP combined with CIPFEP：cefepime；CIP：ciprofloxacin.

2.3 FIC分布情况

FEP与MEM联用时，表现为协同作用32.8%，相加作用46.6%；FEP与CIP联用时，表现为协同作用20.7%，相加作用51.7%。表明上述两种组合均有一定的联合效应。各组药物联用对MDRPA 的FIC 指数分布详见表2。

表2 头孢吡肟分别与美罗培南、环丙沙星联用对MDRPA的FIC指数Table 2 FIC indices of FEP combined with MEM or CIP [n=58, n(%)]

3 讨 论

PA广泛存在于自然界和医院环境内，环境适应力极强，为重要的院内条件致病菌，老年病房内更为普遍。PA耐药机制复杂，几乎具有目前所知细菌的主要耐药机制。老年患者在PA感染率高的同时，大剂量和高频率的应用广谱抗生素，更易选择出多重耐药菌株[5]。随着PA的耐药率逐年升高，传统的单药治疗模式已经很难收到良好效果，联合用药可降低单一用药剂量，从而减少不良反应[6]，两种甚至更多种抗生素联合应用已成为趋势。

FEP为第四代头孢菌素，与第三代头孢菌素相比，抗菌谱更广，可更快速穿透革兰阴性杆菌细胞膜，结合多种青霉素结合蛋白发挥作用；对细菌产生的β-内酰胺酶具有更高稳定性以及更低诱导作用，且对可分解第三代头孢菌素的AmpC 酶有良好作用。FEP因其高效性成为研究的热点，有研究表明其治疗老年呼吸道感染有效性高[7]。MEM属于碳青霉烯类抗生素，曾是治疗PA感染的杀手锏，能够通过抑制细菌细胞壁的合成而对PA产生抗菌作用，故本研究选取上述两种药物作为联合药敏组合。上述两种药物联合应用后，MIC50及MIC90均较单药应用明显下降，浓度-累积抑菌百分率曲线左移，相加及协同作用达到79.4%，证明两种药物适合联合应用。亓芳等[8]认为MEM与其他药物联合治疗MDRPA效果较好，与本研究结论一致。在安全性方面，张巧趁[9]曾报道MEM联合头孢类抗生素治疗临床效果确切，不良反应小，安全性较高。而本研究随着浓度-累积抑菌百分率曲线左移，两种药物治疗浓度均相应下降，也保证了联合用药的安全性。

喹诺酮类药物作用的靶酶为细菌的DNA回旋酶及拓扑异构酶Ⅳ，抑制细菌的DNA复制而导致细菌死亡[10]。但随着喹诺酮类药物使用的增加，耐药率也随之升高。因为细菌DNA 螺旋酶gyrA 基因和拓扑异构酶IV parC 基因中某些保守区域的单个基因突变可造成氟喹诺酮类药物耐药。有研究表明[11]gyrA 和parC 基因突变都与细菌对CIP高水平耐药(MIC≥16 μg/ml)相关，本研究所选的部分MDRPA对CIP高水平耐药，可能与此机制相关。FEP与CIP联合后，相加及协同作用共为72.4%，取得了很好的效果，并且在联合用药后，MIC50及MIC90明显下降。而在刘春都等[12]研究中上述两种药物联合后主要表现为无关作用。可能由于所选菌株虽同为MDRPA，但具体耐药机制仍有差异。亦有研究表明在我国不同地区用药不同，细菌耐药性亦存在较大差异[13]。

综上，本研究将FEP分别与MEM和CIP联合对临床分离的MDRPA进行体外药物敏感试验发现，FEP分别与二者联合用药后主要表现为协同及相加作用，比单独应用时MIC50和MIC90明显下降，相加及协同作用均在70%以上，表明上述药物组合对MDRPA具有很好的体外抗菌活性，可作为参考。但由于不同地区细菌耐药性存在差异，故应重视临床药敏结果。目前多种抗生素联合应用已成为应对MDRPA感染的一个有效手段，愿老年患者能在我们的不断探索中获益。