王芳 余柯达 杨丽华 何健英 毛佳婷 邹立波

多囊卵巢综合征（PCOS）是一种与女性激素代谢失调有关的疾病，在世界范围内育龄妇女中发病率约5%～10%［1］。PCOS患者通常表现为无排卵、高雄激素水平、月经不调，闭经及痤疮等症状，而这些症状促使PCOS成为不孕症的主要原因之一［2］。PCOS还与胰岛素抵抗、肥胖及血脂异常密切相关，并增加2型糖尿病和心血管疾病的患病风险。据报道，遗传背景、环境因素、慢性炎症及氧化应激均与PCOS的发生有关［3］。研究表明，PCOS中颗粒细胞（GCs）的失调可能是卵泡发生异常和雄激素产生过量的原因之一［4］。因此，探索GCs细胞潜在的发病机制具有临床意义。MicroRNAs（miRs）是一类由内源基因组序列编码的非编码RNA分子，miRs参与较多疾病（包括PCOS）的病理进展过程，因此有望成为PCOS诊断新的生物标志物和治疗靶点［5］。本研究比较PCOS患者和同龄健康女性外周血中miR-105-3p的表达水平，并通过转染人卵巢颗粒细胞（KGN）细胞，观察过表达miR-105-3p对KGN细胞增殖凋亡的影响。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2018年10月至2019年9月本院生殖医学中心就诊的PCOS患者30例，PCOS的诊断基于2003年修订的鹿特丹欧洲人类生殖与胚胎学会/美国生殖医学学会标准。同时，收集同龄健康女性30例作为对照组。记录临床信息和生化结果。本项目经本院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 方法 （1）qRT-PCR：采用Trizol法提取外周血中总RNA，逆转录成cDNA后进行 qRT-PCR。MiR-105-3p上游引物：5'-TGTGCATCGTGGTCAAATGCTCAGA-3'，下游引物：5'-TAGACACCGTAGCACATGCTCAAAC-3'；以U6核内小RNA作为内参基因，U6上游引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。（2）KGN细胞体外转染、细胞增殖和凋亡试验：采用lipofectamine 2000转染试剂转染miR-105-3p mimics和mimics negative，转染48h后消化各组KGN细胞，并用qRT-PCR测定miR-105-3p的表达变化。细胞增殖试验采用MTT比色法观察细胞增殖情况，于转染24h、48h、72h和96h测定在480nm波长处的吸光度。细胞凋亡试验采用酶联免疫吸附测定转染48h的细胞凋亡情况，检测在450nm波长处的吸光度。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件。qRTPCR数据采用7500 Software v2.0软件对结果进行分析，2-△△Ct法计算基因相对表达量。计量资料以（±s）表示。两组比较用双尾独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床资料及生化指标 PCOS组与对照组的平均年龄差异无统计学意义（P＞0.05）。与对照组比较，PCOS组体质量指数、黄体生成素、雌二醇、催乳素、总睾酮及游离睾酮含量、卵巢体积和卵巢滤泡数均较高（P＜0.05），而卵泡刺激素含量和每年月经次数则较低（P＜0.05），见表1。

表1 临床资料及生化指标比较（±s）

表1 临床资料及生化指标比较（±s）

项目 PCOS组（n=30） 对照组（n=30） P值年龄（岁） 26.43±3.09 25.17±4.10 ＞0.05体质量指数（kg/m2） 22.57±3.80 20.22±3.49 ＜0.05卵泡刺激素（IU/L） 5.31±1.02 6.92±1.38 ＜0.05黄体生成素（IU/L） 10.79±3.50 7.32±2.77 ＜0.05雌二醇（ng/L） 83.10±13.22 35.08±9.91 ＜0.05催乳素（μg/L） 27.95±7.38 13.84±5.21 ＜0.05总睾酮（μg/L） 1.12±0.02 0.48± 0.09 ＜0.05游离睾酮含量（ng/L） 19.60± 4.83 5.32±1.51 ＜0.05卵巢体积（cm3） 10.05±3.24 6.18±1.50 ＜0.05卵巢滤泡数（个） 15.82±4.29 4.30±1.48 ＜0.05每年月经数（次） 5.73±1.72 9.41±2.06 ＜0.05

2.2 miR-105-3p相对表达量 PCOS组外周血中miR-105-3p的表达量为（0.29±0.15），而对照组为（1.0±0.31），miR-105-3p在PCOS患者外周血中的表达量显著低于对照组（P＜0.05）。见图1。

图1 两组外周血中miR-105-3p表达比较

2.3 KGN细胞转染效率 采用荧光显微镜观察KGN细胞转染miR-105-3p mimics和mimics negative的转染效率，miR-105-3p mimics和mimics阴性对照转染成功的细胞显示大量绿色荧光，而空白对照组细胞未见绿色荧光。再采用qRT-PCR分析KGN细胞中miR-105-3p的表达变化（见图2），结果显示KGN细胞转染48h后，miR-105-3p mimics转染的细胞中miR-105-3p的表达量几乎为mimics阴性对照的16倍（P＜0.05）。

图2 KGN细胞转染后miR-105-3p的表达量改变

2.4 过表达miR-105-3p对KGN细胞增殖和凋亡的影响 MTT比色法显示（见图3A），KGN细胞转染mimics negative 24h、48h、72h和96h后细胞在480nm处的吸光度分别为（0.41±0.03）、（0.53±0.05）、（0.72±0.06）及（0.98±0.10），而miR-105-3p mimics后细胞吸光度仅为（0.33±0.04）、（0.45±0.06）、（0.60±0.05）及（0.87±0.07）。在4个时间点miR-105-3p mimics的吸光度均显著低于mimics阴性对照（P＜0.05）。酶联免疫吸附测定显示KGN细胞转染48h后，miR-105-3p mimics的Caspase-3、Bax浓 度为（4.17±0.62）、（9.03±1.38）pg/ml，高于mimics阴性对照（P＜0.05），而miR-105-3p mimics的Bcl-2仅为（2.70±0.64）pg/ml，显著低于mimics阴性对照（P＜0.05），见图3B。

图3 过表达miR-105-3p对KGN细胞增殖（A）和凋亡（B）的影响

3 讨论

PCOS是一种常见的生殖障碍，异常卵泡发生被认为是PCOS最重要的病理特征。众所周知，GCs细胞在卵母细胞发育过程中起十分关键的作用，目前研究已经证明GCs细胞凋亡与PCOS的发生和发展密切相关［6］。因此，探究GCs凋亡的机制对临床PCOS的防治具有重要价值。MiRs是一类长度为21～25个核苷酸的非编码单链RNA序列，并且通过影响mRNA的稳定性或翻译过程在转录后水平负调节基因表达。近年来，有关PCOS与miRs表达异常的研究已有文献报道。Roth等［7］通过对卵泡液微阵列分析显示235个miRs在PCOS患者和正常女性中呈现差异表达，其中miR-32、miR-34c、miR-135a、miR-18b和miR-9在PCOS患者卵泡液中显著高于正常女性卵泡液。Long等［8］发现PCOS患者外周血中miR-222，miR-146a和miR-30c的表达水平较正常对照组女性外周血显著增加。Murri等［9］研究发现，与体型较瘦PCOS患者相比，肥胖PCOS患者外周血中miR-21、miR-27b、miR-103和miRNA-155的表达水平均显著增加。上述结果表明miRs在PCOS中呈现异常表达，并与PCOS病理过程密切相关。

研究发现，miR-105在多种肿瘤中呈现异常表达，并发挥抑癌或者促癌作用［10-11］。miR-105-3p属于miR-105的成熟体之一，根据之前的深度测序报道，miR-105-3p在PCOS患者中的表达显著低于健康对照组女性，提示该miR可能在PCOS发生和发展中起重要作用。本研究结果显示，PCOS患者体质量指数、黄体生成素、雌二醇、催乳素、总睾酮及游离睾酮含量、卵巢体积和卵巢滤泡数均较健康女性高（P＜0.05），而卵泡刺激素含量和每年月经次数较健康女性低（P＜0.05），表明PCOS患者类固醇激素含量及月经明显异常。同时，miR-105-3p在PCOS患者外周血中的表达量显著低于对照组（P＜0.05），该结果与Xue等［12］报道结果完全一致，表明miR-105-3p在PCOS中呈现明显低表达状态。

在卵巢卵泡发育过程中，＞99%的卵泡发生退行性闭锁，仅少数卵泡能够排卵，已经证明GCs细胞的凋亡与卵泡闭锁有关［6］。近年来，越来越多的证据表明，miRs参与卵巢GCs细胞的增殖、分化和凋亡［13］。本研究MTT比色法显示，转染miR-105-3p mimics的KGN细胞在四个时间点的吸光度均显著小于mimics阴性对照（P＜0.05），表明过表达miR-105-3p mimics可显著抑制KGN细胞增殖。细胞凋亡试验结果表明，转染miR-105-3p mimics KGN细胞的Caspase-3和Bax的浓度显著高于mimics 阴性对照（P＜0.05），Bcl-2反之，提示过表达miR-105-3p mimics可显著促进KGN细胞凋亡。表明低表达miR-105-3p主要通过抑制GCs细胞增殖并促进凋亡进而调控PCOS的病理过程。

综上所述，miR-105-3p在PCOS患者外周血中表达下调，体外过表达miR-105-3p可显著抑制KGN细胞生长并促进凋亡，提示miR-105-3p与PCOS病理过程密切相关，并可能作为PCOS诊治的新的候选物标志物。本研究的下一步计划将筛选miR-105-3p的下游靶基因，并阐明其对靶基因的调控作用。