邵荣学 周辉 潘浩 乐军 陈宝英

骨关节炎（OA）是以关节及周围滑膜的增生、肥厚，软骨的降解、破坏，软骨下骨的囊性变、继之硬化，边缘性骨赘形成等为病理改变，以关节肿痛、僵硬、活动受限为临床表现的一种常见疾病［1］。其中以膝骨关节炎（KOA）最为常见，而KOA的发病机制目前尚未明确。有研究表明，活血止痛方能够有效缓解膝骨性关节炎患者的关节肿胀、疼痛等症状，促进关节功能恢复［2］。但其作用机制尚未明确，有研究证实Wnt/β-catenin信号通路通过调控关节软骨发育、骨化、重塑、骨折修复等，参与KOA的发生与发展［3-7］。2018年6月至2019年3月作者通过建立KOA大鼠模型，探讨活血止痛方保护关节软骨的作用机制，为临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 清洁级健康雄性Sprague-Dawley大鼠36只，6个月龄，体重280～310g，由浙江中医药大学实验动物中心提供。按照随机数字表法，将大鼠分为中药组、模型组和对照组，每组12只，用体积分数4%的水合氯醛（1ml/l00g）腹腔注射麻醉，中药组和模型组采用改良Hulth法［8］复制KOA模型；对照组切开膝关节处皮肤、打开关节腔，不切断内侧副韧带及前交叉韧带，不摘除内侧半月板。术后连续3d，每天用碘伏消毒所有大鼠手术切口、且予以2万U青霉素肌肉注射预防感染早晚各1次。术后第4天开始，强迫大鼠跑步0.5h/d，连续4周。

1.2 药物制备及干预 术后第5周开始中药组灌服活血止痛方汤药进行治疗，灌服量为2ml/（次·d），模型组和对照组灌服等量的生理盐水，1次/d，直到取材。其中活血止痛方（赤芍药12g，红花3g，川穹10g，当归12g，三七6g，紫金藤15g，苏木10g，积雪草6g，地鳖虫10g，陈皮10g，丹参10g，乳香10g），其提取物按照人与大鼠体表面积折算，含生药量0.8377g/ml（由杭州市中医院制剂室提供）。

1.3 实验仪器 光学显微镜（OLYMPUS，Japan）；电子天平（Startorius，德国）；自动双重纯水蒸馏器（SZ-93，上海亚荣生化仪器厂）；超净工作台（SW-CJ-1FD型，苏州净化设备有限公司）；冰冻切片机（AO，美国）等。

1.4 观察指标（1）大体观察：术后第8、12周，每组随机取6只大鼠。乙醚诱导麻醉，断颈法处死大鼠，解剖膝关节。肉眼观察膝关节软骨表面及关节边缘改变、滑膜炎性改变。KOA的判断方法：肉眼大体观察，根据文献报道的评分标准［9］，由与本实验无关的同一组人员，采用盲法评分。见表1。（2）Mankin评分：将上述标本按照文献报道的评分标准［10］，由与本实验无关的同一组人员，采用盲法进行半定量评分，计算每个标本的总分。见表2。（3）病理形态学观察：将上述膝关节标本从股骨远端及胫骨近端同软骨下骨切下，按脱钙操作程序常温脱钙6周，更换脱钙液1次/2周。脱钙完成后，取内侧半胫骨关节面，修成1.5mm×1.5mm×2.5mm的组织块。冷冻切片机箱内温度-25℃，片厚10μm下连续切片，室温晾干，然后行苏木精/番红-O/固绿复染。病理切片干燥后，进行倒置相差显微镜下观察并拍照。（4）软骨组织β-catenin、MMP-13和TNF-α基因的表达：将上述膝关节标本从股骨远端及胫骨近端同软骨下骨切下，应用半定量RT-PCR技术检测不同取材时期各组SD大鼠软骨组织中β-catenin、基质金属蛋白酶（MMP）-13、TNF-α基因的表达量，其RT-PCR 引物序列见表3。

表1 关节软骨病变大体评分标准

表2 Mankin软骨组织形态学改变评分标准

表3 基因RT-PCR 引物序列表

1.5 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大体观察 术后第8周剖开右膝关节：中药组和对照组见软骨表面光滑，色泽正常，软骨大体评分为0分（见图1A）；模型组见滑膜增生明显，软骨失去正常光泽，关节面粗糙，呈磨损性变，软骨缺损，关节边缘有骨赘形成，关节软骨大体评分为1～2分（见图1B）。术后第12周：中药组见滑膜轻度充血水肿，软骨表面色暗红，失去正常光泽，软骨表面欠光滑但尚平整，软骨大体评分为0～1分（见图1C）；模型组膝关节肿胀变形，关节活动不利，膝关节滑膜呈结节样增生，软骨失去正常光泽，关节面粗糙，呈磨损性变，软骨剥脱，软骨下骨暴露，关节边缘有骨赘形成，关节软骨大体评分为3～4分（见图1D）；对照组见软骨表面光整，色泽正常，软骨大体评分为0分。

图1 术后8、12周关节情况

2.2 病理形态学观察 术后第8周：中药组见滑膜组织细胞呈单层排列，滑膜下毛细血管未见增生，间质无明显水肿，偶见少量单核、淋巴细胞浸润（见图2A）；软骨形态正常，软骨细胞各层次排列规则、分布均匀，表面光整，潮线清晰，细胞呈柱状排列，偶见表层软骨变薄，呈裂隙样改变（见图2B）。模型组见滑膜细胞增生明显，可见炎性浸润，主要为淋巴细胞浸润，部分区域可见单核细胞浸润以及细胞凋亡，滑膜下层毛细血管增生明显，可见结缔组织增生（见图2C）；软骨表面紊乱，失去正常光泽，可见软骨表层剥脱，呈绒毛状，其软骨细胞柱状排列消失，有细胞簇出现，软骨下骨未见明显异常改变（见图2D）。sham组滑膜组织细胞排列整齐，间质无水肿，滑膜下毛细血管未见增生，无炎性细胞浸润；软骨形态正常，软骨细胞各层次排列规则、分布均匀，表面光整，潮线清晰。术后第12周：中药组见滑膜轻度增厚，间质轻度水肿，有少量单核、淋巴细胞浸润，滑膜下层毛细血管轻度增生，偶见纤维化（见图3A）；关节软骨结构轻度破坏，软骨表层染色减少，无明显破裂或大片失染，偶见潮线中断、软骨细胞簇集现象，骨小梁结构基本完整（见图3B）。模型组见滑膜细胞增生明显，并可见明显的炎细胞浸润，主要为淋巴细胞，滑膜下毛细血管增生，纤维化明显（见图3C）；关节软骨剥脱、粗糙，软骨细胞凋亡明显、残存软骨细胞排列杂乱，骨小梁的结构紊乱，软骨下骨增生硬化（见图3D）。对照组的结果与第8周相似。

图2 术后8周关节病理

图3 术后12周关节病理

2.3 软骨大体评分和Mankin评分 对照组软骨大体评分和Mankin评分均为“0”分，其他两组的软骨大体评分和Mankin评分随着时间变化而增高，两个时间点中药组评分均低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

表4 各组软骨大体评分、Mankin评分（±s）

表4 各组软骨大体评分、Mankin评分（±s）

注：与模型组比较，*P＜0.05；与对照组比较，#P＜0.05

组别 时间（周） n 软骨大体评分（分） Mankin评分（分）中药组 8 6 1.00±0.63*# 2.50±1.05*#模型组 8 6 1.83±0.75# 5.33±1.03#对照组 8 6 0 0中药组 12 6 2.16±0.75*# 6.83±1.47*#模型组 12 6 3.33±0.82# 9.67±1.21#对照组 12 6 0 0

2.4 软骨组织β-catenin、MMP-13和TNF-α基因的表达 不同时间点模型组β-catenin、MMP-13和TNF-α基因mRNA的表达量均高于中药组和对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；中药组β-catenin、MMP-13和TNF-α基因表达量均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图4。

图4 软骨组织β-catenin、MMP-13和TNF-α基因的表达

3 讨论

本研究结果显示，中药组、模型组和对照组术后不同时间点膝关节软骨中均检测到β-catenin、MMP-13和TNF-α基因的表达，不同时间点模型组上述基因mRNA的表达量均高于中药组和对照组；中药组上述基因表达量均高于对照组。正常膝关节软骨细胞外基质主要由蛋白多糖和Ⅱ型胶原组成，基质金属蛋白酶家族由锌肽链内切酶组成，能降解多种细胞外基质蛋白成分包括蛋白多糖和Ⅱ型胶原。其中MMP-13广泛存在于骨关节炎患者的关节软骨和滑膜中，其裂解Ⅱ型胶原的作用较强，被认为是裂解Ⅱ型胶原作用最强的酶［11］。TNF-α是关节炎病理改变过程中促进软骨基质降解和关节软骨破坏的最重要细胞因子［12］。其能够刺激蛋白多糖的消耗和胶原网络的损伤并减少软骨基质蛋白的合成，诱导基质金属蛋白酶（MMPs）、尤其是MMP-13的高表达，促进软骨基质内胶原的降解，促进关节滑膜皱襞增生、炎症进展，改变关节软骨细胞正常结构与功能，促进软骨细胞凋亡；改变软骨中胶原成分，造成关节软骨生存的微环境恶化，促进骨性关节炎加重［13-16］。上述研究与本资料结果一致，β-catenin、MMP-13和TNF-α基因的表达参与KOA 的产生和发展。本实验结果显示，术后不同时间点中药组膝关节软骨中β-catenin、MMP-13和TNF-α基因的表达量均低于模型组，从而证实活血止痛方药能延缓KOA的进展。

尽管近年来对KOA的研究取得较多成绩，但其发生和发展机制仍知之甚少。前期研究证实典型的Wnt/β-catenin信号通路是一个关键的信号通路，参与调节KOA发病机制之一。主要病理特征为软骨基质退化、软骨下骨改变和软骨周围骨赘形成等，最终导致关节僵硬和疼痛。根据本实验结果推测，活血止痛方能保护或修复膝关节软骨细胞，重塑细胞的衰老平衡稳态，延缓关节病损，促进病损关节的康复，其机制可能通过调控Wnt/β-catenin信号通路保护膝关节软骨有关，其具体机制尚待进一步研究。