吴朝暄

摘 要 为研究不同种花椒精油的抗氧化能力，使用ABTS法、DPPH法、β-胡萝卜素漂白法、FARP法对不同花椒品种精油进行抗氧化分析。结果表明，竹叶椒的抗氧化能力尤为突出，其次是大红袍，随后是豆椒。虽然竹叶椒是一种药用价值高于食用价值的花椒品种，但是在抗氧化能力方面高于其他三种花椒，这取决于其得天独厚的生长环境，即生于海拔2 300 m的山坡疏林、灌叢中及路旁，分布于华东、中南、西南及陕西、甘肃、台湾等地，只有在6—8月果实成熟时才能采收。

关键词 花椒;抗氧化;精油

中图分类号：S432.2+2 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2020.30.071

植物精油是一类天然植物次生代谢物，具有杀菌、抗病毒和抗氧化等生物活性，在香料、食品、制药及农业害虫防治等方面得到了广泛应用。本研究提取了产自全国各地将近22余种不同花椒籽的精油，并采用ABTS法、DPPH法、β-胡萝卜素漂白法、FARP法进行抗氧化分析，为花椒精油在食品、医疗保健品等方面的加工应用提供参考[1-2]。

1 材料与方法

1.1 材料

试验仪器：722/722S型光栅分光光度计（上海精密仪表仪器有限公司），BS200S型电子天平（北京赛多利斯天平有限公司），CN69M/FW80高效植物样品粉碎机（北京中西远大科技有限公司）。

试验材料：共22种花椒，见表1。

化学试剂：乙醇、醋酸、无水硫酸钠，天津化学试剂厂;北京中西科仪科技有限责任公司的二苯代苦味肼基（DPPH）;Sigma公司的2，2-联氮基-双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二氨盐（ABTS）;上海伊卡生物技术有限公司的三吡啶基三嗪（TPTZ）;海星生物科技有限公司的亚油酸β-胡萝卜素;美国AlfaAesar公司吐温80;上海耐因公司的HCl;K2S2O8;FeCl3·6H2O;氯仿。

1.2 方法

1.2.1 精油的提取

参照李大强等的方法，用CN59M/FW80高效植物样品粉碎机将花椒原料粉碎，称取粉碎原料100 g，加入

1 000 mL蒸馏水浸泡12 h，然后进行蒸馏，蒸馏2～3 h，将馏出液用冷凝水冷凝收集，然后转移到离心管内并使用无水硫酸钠干燥，即可获得精油[3]。22组样品依次使用此方法进行精油提取并编号，并将精油放置在4 ℃冰箱中保存。

1.2.2 DPPH自由基清除率测定

参照陆占国等的方法，用无水酒精配制浓度为

6.0 mg·mL-1的精油溶液，分别将2.0 mL样品溶液和

2.0 mL浓度为10 mmol·L-1的DPPH溶液混匀后暗处放置30 min，以无水乙醇作参比，在517 nm处测定其吸光值A;同样测定2.0 mL样品溶液与2.0 mL无水乙醇混合后

517 nm处的吸光值A0;再测定2.0 mL DPPH溶液与

2.0 mL无水乙醇混合液在517 nm处的吸光值A1，按公式（1）计算其清除率[4]。

（1）

1.2.3 ABTS自由基清除率测定

参照朱玉昌等的方法配制2 mmoL·L-1 ABTS溶液，吸取50 mL上述溶液与200 mL K2S2O8溶液（70 mmoL·L-1）

混合，暗处放置12～16 h，得到ABTS自由基溶液。用PBS（pH 7.4，0.1 moL·L-1）缓冲液将ABTS自由基溶液稀

释，使其在745 nm下的吸光度为0.70±0.20[5]。用无水乙醇配制浓度为6.0 mg·mL-1的精油溶液，取0.5 mL稀释溶液，加入4.5 mL ABTS自由基溶液，在745 nm处测其吸光值A，按公式（2）计算清除率：

（2）

式中，A0为ABTS自由基溶液的吸光度，A为加精油溶液后的吸光度。

1.2.4 FRAP法测定抗氧化活性

参照Chaillou LL等的方法，将300 mol·L-1的醋酸缓冲液（pH 3.6）、20 mmoL·L-1 FeCl3·6H2O溶液、10 mmol·L-1

TPTA溶液（现用现配）以10∶1∶1（体积比）混合，得TPTA工作液[6]。准确吸取样品溶液0.3 mL，加入

2.7 mL预热至37 ℃的TPTZ工作液，摇匀后放置10 min，

于595 nm波长处测其吸光度，以无水乙醇代替样品加入FRAP工作液作为空白，每个样品做3次平行试验.由反应后吸光度在标准曲线上获得的相应的Trolox×质量分数定义为FRAP值（mg Trolox/g提取物）。

1.2.5 β-胡萝卜素漂白法测定抗氧化活性

参照Shah MA等的方法，将1 mL含有β-胡萝卜素（1 mg·mL-1）的氯仿溶液置于梨形瓶，加入40 μL亚油酸和400 μL吐温80，然后于40 ℃旋转蒸发减压去除氯仿，再加入100 mL蒸馏水，于混匀器中形成乳化液。取0.2 mL各种植物提取物（稀释到合适质量浓度）和

4.8 mL乳化液于试管中，然后将所有试管置于50 ℃恒温水浴锅中，在120 min后测定反应终点在470 nm波长下的吸光度值，对照管不含试样，以体积分数为70%乙醇代替[7]。

β-胡萝卜素的清除率用下式进行计算：

（3）

其中A0s表示样品在0 min时的吸光度，A∞s是样品在终点的吸光度，A0c是空白对照样品在0 min时的吸光度，A∞c是空白对照样品在终点的吸光度。

2 结果与分析

2.1 22种精油的提取率

经过提取发现，产于陕西省凤县和陇南市武都区的大红袍花椒样品出油率尤为突出，分别是5.50%、5.40%。甘肃省天水市秦安县郭嘉镇的油椒和天水市张家川回族自治县的油椒在供试油椒品种中出油率略高，分别是3.0%、2.3%;静宁县仁大乡南门村的豆椒出油率为2.2%，云南省邵通市永善县和四川金阳的青花椒出油分别为5.4%、5.0%，湖南祁阳的竹叶椒出油率则是1.8%，

详见表1。

2.2 不同品种的抗氧化能力

2.2.1 DPPH自由基清除率

如图1所示，在14组样品中，处于相同的6.0 mg·mL-1浓度，清除率最高的三个样品是10号定西临洮辛店镇杜家村、6号河南省兰考县、11号四川汉源，清除率分别是91.39%、91.06%、90.86%。

如图2所示，纵坐标是DPPH自由基清除率，横坐标中15～18号代表的是油椒，19号是豆椒，20号、21号是青花椒，22号是竹叶椒。油椒清除率最高的是18号样品，产地是庄浪，清除率为91.55%，19号样品静宁县仁大乡南门村豆椒清除率为90.65%，青花椒清除率最高的是20号样品，产地四川省金阳县，清除率为91.44%，22号样品竹叶椒产地湖南祁阳，清除率为91.05%。

22个样品共5个花椒品种，在DPPH试验中每种样品清除率的算数平均数分别为：竹叶椒91.50%，豆椒90.65%，青花椒89.80%，油椒88.40%，大红袍88.13%。

2.2.2 ABTS自由基清除率

如圖3所示，在图中，清除率最高的依次是8号陇南市武都区磨坝乡、10号定西临洮辛店镇杜家村、1号咸阳礼泉县绍陵镇孙家村，相对应的清除率分别是71.83%、71.58%、71.39%。

如图4所示，纵坐标是ABTS自由基清除率，横坐标中15～18号代表的是油椒，19号是豆椒，20、21号是青花椒，22号是竹叶椒。油椒清除率最高的是17号样品，产地是甘肃省天水市秦安县郭嘉镇，清除率为69.38%，19号样品静宁县仁大乡南门村豆椒清除率为68.6%，青花椒清除率最高的是20号样品，产地四川省金阳县，清除率为68.81%，22号样湖南祁阳竹叶椒清除率为68.78%。

22个样品共5个花椒品种，在ABTS试验中每种样品清除率的算数平均数分别为：大红袍71.16%，豆椒68.60%，青花椒68.39%，竹叶椒67.97%，油椒65.33%。

2.2.3 FRAP法测定抗氧化活性

如图5所示，纵坐标是FRAP值（mg Trolox/g提取物），横坐标是14组大红袍样品，花椒精油的抗氧化活性从高到低依次是6号河南省兰考县>3号永靖县三条砚乡大台子村>5号甘肃省天水市秦安县。

如图6所示，纵坐标是FRAP值，横坐标中15～18号代表的是油椒，19号是豆椒，20号、21号是青花椒，22号是竹叶椒。油椒中抗氧化活性最强的是15号样品，产地是天水市张家川回族自治县;19号产地为静宁县仁大乡南门村的豆椒样品在这8种样品中的抗氧化活性最强，青花椒抗氧化活性最强的是20号样品，产地四川省金阳县。

22个样品中共5个花椒品种，在FRAP试验中每个样品FRAP值的算数平均数从大到小依次为豆椒>油椒>大红袍>青花椒>竹叶椒。

2.2.4 β-胡萝卜素漂白法测定抗氧化活性

如图7所示，纵坐标是β-胡萝卜素清除率，横坐标是14组大红袍样品。由水浴前的吸光值和水浴后的吸光度进行公式换算得到抑制率。在14组样品中，如果处于相同的6.0 mg·mL-1浓度，清除率最高的三个样品是11号四川汉源、4号陕西凤县、8号陇南市武都区磨坝乡，清除率分别是71.44%、70.82%、70.81%。

如图8所示，纵坐标是β-胡萝卜素清除率值，横坐标中15～18号代表的是油椒，19号是豆椒，20号、21号是青花椒，22号是竹叶椒。油椒清除率最高的是16号样品，产地是临夏县南塬乡，清除率71.39%;19号样品静宁县仁大乡南门村豆椒清除率71.10%;青花椒清除率最高的是20号样品，产地四川省金阳县，清除率67.77%;22号样湖南祁阳竹叶椒，清除率71.40%。

22个样品共5个花椒品种，在β-胡萝卜素清除率实验中每种样品清除率的算数平均数分别为：竹叶椒71.40%，豆椒71.10%，油椒70.32%，大红袍68.74%，青花椒67.32%。

2.3 聚类分析

如图9所示，使用4组不同的抗氧化实验得到结果为数据基准，使用软件进行聚类分析。以纵坐标为6这条线可将22组样品一共分为三大类，第一大类中分别有陕西凤县的大红袍、四川汉源的大红袍、甘肃省临夏县南塬乡的油椒、四川省金阳县的青花椒、定西临洮辛店镇的大红袍、咸阳礼泉县绍陵镇的大红袍、三门峡灵宝县西闫乡的大红袍、甘肃省平凉市庄浪的油椒、榆林市西沙聚财巷的大红袍、高峻区鹿苑镇安宋村的大红袍（其样品号为4、11、16、20、10、1、14、18、7、9）。第二类中有甘肃省天水市秦安县的大红袍、天水市张家川回族自治县的油椒、永靖县三条砚乡的大红袍、静宁县仁大乡南门村的豆椒、河南省兰考县的大红袍、陕西省韩城桑树坪镇的大红袍（其样品号为5、15、3、19、6、2）。第三类中有甘肃省天水市秦安县的油椒、湖南祁阳肖家镇的竹叶椒、陇南市武都区磨坝乡的大红袍、天水市张家川回族大红袍、云南邵通永善县的大红袍、陕西省富平县塬原乡的大红袍（其样品号为17、22、8、13、21、12）。

3 讨论

3.1 ABTS清除能力

本实验首先测定了22种花椒精油提取物的含量，结果表明，产于陕西凤县和陇南武都的花椒样品出油率尤为突出，分别是5.50%、5.40%。通过ABTS自由基清除率法、FRAP测定法、β-胡萝卜素漂白测定法和DPPH自由基清除率实验，对各种花椒植物精油提的抗氧化活性进行评估。

ABTS在适当的氧化剂作用下可被氧化成绿色的ABTS+自由基，在抗氧化物存在时ABTS+的产生会被抑制[8]，因此可以确定ABTS法可用于检测抗氧化物清除ABTS+自由基的能力。

3.2 FRAP测定抗氧化物还原Fe3+-PTZ的能力

FRAP测定抗氧化物还原Fe3+-TPTZ的能力。这两种方法的结果都以Trolox×为衡量标准，即1 g受试物清除自由基（或还原Fe3+）的能力相当于Trolox×清除自由基（或还原Fe3+）的量。本实验结果表明，陇南市武都区磨坝乡的大红袍自由基能力最高。

3.3 β-胡萝卜素漂白能力

β-胡萝卜素漂白测定法的原理为乳状漩浊液中的亚油酸氧化，生成的自由基与β-胡萝卜素发生一定反应，引起β-胡萝卜素的黄色衰减（A470值减小）。β-胡萝卜素漂白试验结果却和ABTS及FRAP法不一致。

綜合这3种抗氧化活性检测法，可见花椒精油提取物的抗氧化作用方式有所差异。所以在评价抗氧化物总的抗氧化能力时，需要各种方法同时评价并互为补充，单独使用一两种抗氧化实验方式不足以说明抗氧化物的抗氧化能力。

4 结论

综合以上四个实验（DPPH、ABTS、FRAP测定抗氧化物还原Fe3+-PTZ能力、β-胡萝卜素漂白能力）可以证明，竹叶椒的抗氧化能力尤为突出，其次是大红袍，随后是豆椒，DPPH和β-胡萝卜素漂白能力实验表明竹叶椒的抗氧化能力最优（清除率分别为91.50%、71.40%），并且微微高于大红袍的抗氧化能力。虽然竹叶椒是一种药用价值高于食用价值的花椒品种，但是在抗氧化能力方面高于其他三种花椒，这取决于其得天独厚的生长环境，即生于海拔2 300 m的山坡疏林、灌丛中及路旁，分布于华东、中南、西南及陕西、甘肃、台湾等地，只有在6—8月果实成熟时才能采收。

参考文献：

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[2] 张斌，王家良.花椒油树脂抗氧化性的初步研究[J].中国调味品，2007（7）：33-35.

[3] 李大强.孜然精油的成分分析、抗菌和抗氧化活性[D].兰州：甘肃农业大学，2012.

[4] 陆占国，封丹，李伟.孜然精油的提取及其清除DPPH自由基能力研究[J].化学研究与应用，2008（5）：647-651.

[5] 朱玉昌，焦必宁.ABTS法体外测定果蔬类总抗氧化能力的研究进展[J].食品与发酵工业，2005，31（8）：77-80.

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[7] Shah MA，Bosco SJD，Mir SA.PLant extracts as naturaL antioxidants in meat and meat products[J]. Meat Science，2014，98（1）：21.

（责任编辑：刘 昀）