方 静，朱 琼，蔡 鹏，钱保勇

（泰州市食品药品检验所，江苏泰州 225300）

活血止痛胶囊由当归、三七、乳香（制）、冰片、土鳖虫、自然铜（煅）6味药材组成,具有活血散瘀、消肿止痛之功效,用于治疗跌打损伤、淤血肿痛等［1-3］,方中自然铜主要含有二硫化铁,此外还有少量铝、钙、镁、钛、硅、砷,以及微量铜、铅、锌、锰、镍、铬等20余种元素［4］。不同价态、形态砷对人体毒性的差别很大,依次为亚砷酸盐＞砷酸盐＞一甲基砷＞二甲基砷＞砷甜菜碱＞砷胆碱［5-7］,故为了更好地对活血止痛胶囊毒性及用药安全进行评价,应对其砷形态进行分析。

目前,国内分析砷形态时主要采用选择性好、灵敏度高的高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱（HPLC-ICPMS）法［8-10］。本实验为了反映活血止痛胶囊经口服进入人体后可溶性砷的存在形态,模拟人体胃肠道环境,环境将该制剂以水、人工胃液、人工肠液提取,并采用HPLCICP-MS法进行分析,以期为其砷限量标准建立及用药安全评价提供依据［11］。

1 材料

UltiMate3000型高效液相色谱仪,配置ICP-Q型电感耦合等离子体质谱仪、IonPacTMAS7型阴离子交换树脂柱（4 mm×250 mm）,采样锥、截取锥均为镍（美国Dionex公司）；Milli-Q Reference型超纯水处理系统（美国密理博公司）；SHA-C型恒温振荡器（常州国华电器有限公司）。

亚砷酸盐［编号1604,含砷（75.7±1.2）μg/g］、砷酸盐［编号1512,含砷（17.5±0.4）μg/g］、一甲基砷［编号16072,含砷（25.1±0.8）μg/g］、二甲基砷［编号1607,含砷（52.9±1.8）μg/g］、砷甜菜碱［编号1509,含砷 （38.8±1.1）μg/g］、砷胆碱 ［编号1512,含砷（28.0±1.1）μg/g］标准溶液均购自中国计量科学研究院；Ba、Bi、Ce、Co、Zn、Li、U质谱调协液（编号1323770,3～35 μg/L）均购自美国Thermo Scientific公司。碳酸铵（批号1000148）购自国药集团化学试剂有限公司；甲醇为色谱纯,购自德国默克公司。

活血止痛胶囊共6批,批号分别为20161103 （江西百神药业股份有限公司）、170211 （南京中山制药有限公司）、1501026 （江西百神昌诺药业有限公司）、15060162（珠海安生凤凰制药有限公司）、16060139 （珠海安生凤凰制药有限公司）、17010101 （珠海安生凤凰制药有限公司）。

2 方法与结果

2.1 工作参数 流动相200 mmol/L （NH4）2CO3（A）-10 mmol/L （NH4）2CO3（B）,梯度洗脱,程序见表1；体积流量1.0 mL/min；进样量25 μL；等离子体功率1 550 W；采样深度5 mm；载气体积流量0.91 L/min；蠕动泵转速40 r/min；冷却气体积流量14 L/min；辅助气体积流量0.8 L/min；采样锥、截取锥类型镍锥；标准采样模式（STD）；手动进样；采样质荷比m/z75 （砷）。

表1 梯度洗脱程序

2.2 标准溶液制备 精密称取亚砷酸盐、砷酸盐、一甲基砷、二甲基砷、砷甜菜碱、砷胆碱标准溶液适量,超纯水分别稀释至1 041、1 006、1 001、1 004、1 019、1 005 μg/L（以砷计）,再用超纯水各逐级稀释成6个质量浓度,分别为亚砷酸盐1.04、2.08、4.16、8.33、16.7、20.82 μg/L,砷酸盐1.01、2.01、4.02、8.05、16.10、20.12 μg/L,一甲基砷1.00、2.00、4.00、8.01、16.02、20.02 μg/L,二甲基砷1.00、2.01、4.02、8.03、16.06、20.08 μg/L,砷甜菜碱1.02、2.04、4.08、8.15、16.30、20.38 μg/L,砷胆碱1.00、2.01、4.02、8.04、16.08、20.10 μg/L。

2.3 提取液制备

2.3.1 人工胃液 按照2015年版《中国药典》 四部通则0922［12］,取16.4 mL稀盐酸,加水约800 mL、胃蛋白酶10 g,摇匀后加水稀释至1 000 mL,即得。

2.3.2 稀盐酸溶液 按照2015年版《中国药典》 四部,取234 mL盐酸,加水稀释至1 000 mL,即得。

2.3.3 人工肠液 按照2015年版《中国药典》 四部通则8004［12］,取6.8 g磷酸二氢钾,加500 mL水溶解,0.1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至6.8；另取10 g胰酶,加适量水溶解,将上述2种溶液混合,加水至1 000 mL,摇匀,即得。

2.4 样品前处理

2.4.1 人工胃液提取物 精密称取适量胶囊粉末至锥形瓶中,加入100 mL人工胃液,37 ℃下振荡提取1 h,滤过,少量人工胃液清洗滤渣3次,合并滤液,加人工胃液定容至200 mL,摇匀,0.20 μm微孔滤膜过滤,即得。

2.4.2 人工肠液提取物 人工胃液改成人工肠液,其他操作同“2.4.1” 项,即得。

2.4.3 水提取物 精密称取适量胶囊粉末至锥形瓶中,加100 mL水,37 ℃下振荡提取5 h,滤过,少量水清洗滤渣3次,合并滤液,加水定容至200 mL,摇匀,0.20 μm微孔滤膜过滤,即得。

2.5 线性关系考察 取“2.2” 项下标准溶液,在“2.1”项工作参数下各进样25 μL测定。以溶液质量浓度为横坐标（X）,峰面积为纵坐标（Y）进行回归,再分别为以S/N=3、S/N=10测定检出限、定量限,结果见表2,可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系

2.6 精密度试验 取人工胃液（批号20161103）提取物适量,在“2.1” 项工作参数下进样测定6次,测得亚砷酸盐、砷酸盐峰面积RSD分别为0.96%、2.75% （一甲基砷、二甲基砷、砷甜菜碱、砷胆碱未检测出）,表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验 取同一份供试品溶液 （批号20161103）,4 ℃下于0、2、4、6 h在“2.1” 项工作参数下进样测定,测得亚砷酸盐、砷酸盐峰面积RSD分别为1.08%、2.03%,表明供试品溶液在6 h内稳定性良好。

2.8 加样回收率试验 精密量取人工胃液提取液（批号20161103）10 mL,精密加入供试品溶液1、3、5 mL,混匀,平行3份,在“2.1” 项工作参数下进样测定,结果见表3。

2.9 样品砷形态含有量测定 取6批胶囊,分别按“2.4”项下方法制备水、人工胃液、人工肠液提取物,在“2.1”项工作参数下进样测定,平行6次,离子流色谱图见图1,结果见表4。由此可知,不同厂家、批次样品中均只检出无机砷（亚砷酸盐、砷酸盐）,以砷酸盐为主,其总含有量差异较大,在人工胃液提取物中较高。

表3 各砷形态加样回收率试验结果（n=3）

图1 各砷形态离子流色谱图

表4 各砷形态含有量测定结果（μg/g， n=6）

3 讨论

本实验考察了磷酸二氢铵、碳酸铵作为流动相时的洗脱效果,发现前者易污染采样锥,导致质谱熄火,而后者能较好地避免该类情况发生,故选择其作为流动相。再通过不断调节流动相浓度及比例、更改洗脱时间,最终建立了同时测定活血止痛胶囊中亚砷酸盐、砷酸盐、一甲基砷、二甲基砷、砷甜菜碱、砷胆碱含有量。

前期报道,活血止痛胶囊无机砷在水、人工胃液、人工肠液中的溶出总量远低于总砷。2015年版《中国药典》一部规定,活血止痛胶囊含砷量不得超过300 mg/kg［13］,但未涉及无机砷。因此,可考虑以亚砷酸盐、砷酸盐总含有量代表无机砷总含有量,从而制定相关限量标准,但其毒性和用药安全仍需作进一步研究。

表4显示,不同厂家、批次活血止痛胶囊中无机砷含有量差异较大,可能与原药材质量不同有关。因此,可通过测定原药材中无机砷含有量来将活血止痛胶囊中该类元素总量控制在安全范围内。