张程 吕春晓 李天成 陶贵渝 黄鹂 邹淑娟

牙槽骨在正畸力作用下发生骨塑建，张力侧表现为成骨，压力侧表现为破骨。有效的成骨塑建有助于维持正畸治疗结果的稳定，避免治疗过程中牙齿的过度松动、牙槽骨吸收，是有效、稳定、安全的正畸治疗的生物学基础。加强张应力区的成骨活动，对获得理想的正畸治疗结果、减少牙周并发症具有积极意义，尤其是成骨活动有所减弱的成年患者。

人甲状旁腺激素(PTH)(1-34)(商品名特立帕肽)是一种通过增强成骨活动治疗妇女绝经后骨质疏松的药物[1]，小剂量间歇性给药通过增强成骨活动增加骨量，大剂量给药增强破骨活动，使骨量减少[2]。有研究表明，PTH对重症慢性牙周炎的治疗有较好的效果[3]；在正畸治疗方面，可以通过上调破骨细胞活性加速正畸牙移动[4-5]，有助于保持正畸治疗结果的稳定[6]，促进正畸力引起的牙根吸收的牙骨质修复[7]。以上研究结果表明PTH可能参与了调控正畸牙槽骨塑建过程，但现有文献缺乏此方面研究。深入研究PTH对正畸力作用下牙槽骨塑建的调控机制是临床上精准应用PTH促进牙槽骨成骨塑建、降低牙槽骨吸收及复发风险的基础。

体外研究证实，PTH可以快速促进成骨细胞表达IL-6及其受体[8]。IL-6信号通路的一个重要的胞内下游分子是信号转导与转录激活因子3(STAT3)。研究表明，STAT3的激活促进成骨前体细胞成骨向分化，骨钙素(OCN)表达水平和碱性磷酸酶(ALP)活性提高[9]，并介导了IL-6家族细胞因子oncostatin M促进成骨的作用[10]。此外，STAT3是骨组织中力学信号转导因子，介导了力学加载下骨组织的形成过程[9]。但STAT3是否参与PTH调节张应力引起的牙槽骨成骨塑建过程尚不清楚。本研究通过建立大鼠牙移动模型并应用小鼠成骨前体细胞系MC3T3-e1，初步探究间歇性给予PTH调节正畸牙槽骨塑建中成骨活动的机制及STAT3在此过程中的作用，为临床上改善正畸牙槽骨塑建效果提供潜在靶点。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

α-MEM培养基、胎牛血清(Gibco，美国)；青霉素-链霉素(双抗)溶液、胰蛋白酶(Hyclone，美国)；人甲状旁腺激素(1-34)(Bachem，美国)；Stattic(STAT3抑制剂)(Selleck，美国)。

1.2 实验动物及分组

8 周龄雄性Wistar大鼠24 只(达硕实验动物有限公司)，体重220～250 g，随机平均分为3 组：空白组，间歇性PTH给药组，间歇性PTH给药加Stattic组。间歇性PTH给药组每天相同时间在背部皮下注射40 μg/kg体重的PTH，对照组注射等体积生理盐水。间歇性PTH给药加Stattic组在注射PTH的同时局部注射Stattic，全身麻醉大鼠后，以微量注射器在加力的第一磨牙近中腭侧距龈缘2 mm处进针，于粘骨膜下注射10 μl Stattic(50 μmol/L)，每隔1 d注射1 次，相邻2 次注射间隔48 h；对照组注射等体积生理盐水。从建立牙移动当天起开始注射PTH，提前2 d开始注射Stattic。在牙移动的第14天以过量麻醉法处死大鼠，收集双侧上颌骨，4%多聚甲醛4 ℃固定48 h。

1.3 大鼠牙移动模型建立

大鼠经乙醚吸入麻醉后，将镍钛拉簧结扎于双侧上颌第一磨牙与同侧切牙之间，拉簧力值为40 g。

1.4 免疫组织化学染色及定量分析

标本经10%EDTA溶液脱钙8 周后脱水、石蜡包埋、切片。切片经常规免疫组化染色后，以Image J定量分析第一磨牙远中颊根近牙颈部三分之一张力侧牙周膜区域STAT3平均光密度及单位面积内成骨相关转录因子(osterix,OSX)阳性细胞数。每组随机分析3 张切片，取平均值。

1.5 细胞培养

小鼠成骨前体细胞MC3T3-e1(亚克隆14)，于含10%胎牛血清、1%双抗的α-MEM培养基中扩增；在上述培养基中加入抗坏血酸(终浓度50 μg/ml)、β-甘油磷酸钠(终浓度10 mmol/L)即为成骨诱导液，用于药物刺激实验。

1.6 间歇性PTH给药细胞模型的建立

实验分为空白组，间歇性PTH给药组，间歇性PTH给药加STAT3抑制剂Stattic组。PTH组细胞在含100 ng/ml PTH的成骨诱导液中孵育6 h后，换成不含PTH的成骨诱导液继续孵育18 h，每24 h为1循环，连续3 个循环完成间歇性PTH给药。PTH加抑制剂组细胞在含100 ng/ml PTH和5μmol/L Stattic的成骨诱导液中孵育6 h后，换成仅含5 μmol/L Stattic的成骨诱导液继续孵育18 h，每24 h为1循环，连续进行3 个循环完成间歇性PTH与Stattic的联合给药。

1.7 实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)

用高纯总RNA提取试剂盒(北京百泰克)按说明书提取细胞总RNA，测定RNA浓度和纯度后，用cDNA逆转录试剂盒(Thermo Scientific，美国)合成cDNA，TB Green®Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)(Takara，日本)进行RT-qPCR检测，检测基因名称及正反引物序列见表 1，以Gapdh为内参。

表 1 RT-qPCR引物序列

1.8 蛋白质免疫印迹(WB)

用总蛋白提取试剂盒(Signalway Antibody，美国)提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度后，加入上样缓冲液于99 ℃变性。样本于10%聚丙烯酰胺凝胶电泳后转印至PVDF膜，膜经封闭、抗体杂交后显影。

1.9 统计学分析

2 结 果

2.1 间歇性PTH给药在动物模型及细胞模型中对STAT3通路激活情况的影响

WB结果提示，PTH组MC3T3-e1细胞中STAT3总蛋白及磷酸化蛋白(Tyr705)表达量与对照组相比明显增加(图 1)。免疫组化结果显示，PTH组大鼠在牙移动第14天时，张力区牙槽骨表面成骨细胞内及牙周膜内STAT3表达量与对照组相比明显增加；局部注射Stattic后，STAT3表达量降低(图 2)。

2.2 间歇性PTH全身给药及局部注射STAT3抑制剂Stattic对大鼠正畸牙移动中成骨活动的影响

免疫组化结果显示，PTH组大鼠在牙移动第14天张力区牙槽骨表面OSX阳性成骨细胞数量与对照组相比明显增加，全身PTH给药结合局部注射Stattic组OSX阳性细胞数目较PTH组明显减少(图 3)。

2.3 间歇性PTH给药及STAT3抑制剂Stattic对MC3T3-e1成骨向分化的影响

RT-qPCR结果显示，经过3 个循环的间歇性PTH给药，MC3T3-e1的成骨分化标志基因Col1a1、Osx、Alp、Runx2表达增加；PTH与Stattic共同给药组中，PTH对上述基因的上调作用被削弱，各基因组间表达水平均存在统计学差异(图 4)。

图 1 STAT3和p-STAT3表达在各组MC3T3-e1细胞中的表达

图 2 大鼠牙移动张力侧牙槽骨表面成骨细胞及牙周膜内STAT3表达(免疫组化， ×100)

图 3 大鼠牙移动张力侧牙槽骨表面OSX阳性细胞数量(免疫组化， ×100)

3 讨 论

近年来，寻求正畸治疗的成人患者逐年增加，成人患者行正畸治疗比青少年及儿童存在更高的风险，包括：牙龈萎缩、牙齿松动、牙根吸收、治疗结束后容易复发等。成人患者成骨能力下降，成骨前体细胞储备不足，骨质逐渐流失，是形成上述并发症的主要原因之一[11]。因此，为了给成人患者提供安全有效的正畸治疗，增强牙槽骨塑建过程的成骨活动是一个可能有效的手段。本研究发现，间歇性全身给予PTH可以促进大鼠正畸牙槽骨塑建中张力侧牙槽骨表面细胞的成骨向分化，提高成骨细胞特异性转录因子OSX的表达，该分子为间充质干细胞向成骨细胞分化的关键转录因子，参与启动骨基质分泌及矿化相关的诸多基因的转录[12]；与此同时，间歇性PTH给药也增加该区域成骨细胞内STAT3表达，局部注射STAT3抑制剂Stattic则削弱PTH增加成骨活动的效应及STAT3蛋白的表达，说明STAT3参与了PTH促进成骨塑建的过程。间歇性PTH给药可以上调小鼠成骨前体细胞系MC3T3-e1的STAT3总蛋白和磷酸化蛋白(Tyr705)水平，促进成骨分化相关基因表达，这种作用依赖于STAT3的磷酸化，可以被STAT3抑制剂Stattic削弱。本研究从体内和体外两方面说明，间歇性PTH给药可以促进正畸牙槽骨成骨塑建，并通过激活STAT3发挥作用。

图 4 MC3T3-e1细胞中成骨标志基因Col1a1、Osx、Alp、Runx2的表达

细胞实验结果显示，间歇性PTH可以同时促进STAT3总蛋白和活化态蛋白即磷酸化STAT3(Tyr705)的表达。作为IL-6家族细胞因子重要的胞内下游信号转导蛋白，STAT3激活水平在间歇性PTH刺激后升高，与前期研究PTH促进成骨细胞IL-6释放的结果相符合[8]。此外，有学者发现牙周膜内IL-6和STAT3在牙移动过程中被上调[13]，说明IL-6和STAT3本身可能参与牙移动的牙槽骨塑建过程，而间歇性PTH给药的效应与这一生理反应可能产生了协同作用。

本研究为改善正畸牙槽骨塑建、降低成人正畸治疗并发症提供了新的思路。牙周膜成纤维细胞作为正畸力转导的主要细胞，其在应力微环境下对PTH的反应值得深入研究。此外，PTH对牙槽骨塑建的破骨活动的影响也是下一步的研究方向。