杨祖阁 张赵一淳 任昊喆 王若欣 于世宾 张婧

颞下颌关节紊乱病是口腔临床的常见病，可累及咀嚼肌、颞下颌关节及周围组织[1]，咀嚼肌酸困、疼痛和功能障碍是其主要症状之一。尽管颞下颌关节紊乱病的致病因素众多，咬合因素在其中一直备受关注[2]。已有临床实验证实咬合异常患者的咀嚼肌对疼痛更加敏感且肌电活动明显改变[3-4]。动物实验也证实异常咬合可导致咀嚼肌疼痛阈值显著降低[5-6]，该课题组前期研究发现异常咬合可以造成大鼠咀嚼肌超微结构改变[7]。

本实验旨在全面评价实验性牙齿移动引起的咬合干扰造成咀嚼肌损伤的程度，观察咬肌的组织学和超微结构变化，及骨骼肌损伤标志物结蛋白(desmin)和骨骼肌肌钙蛋白抑制亚基(skeletal muscle troponin I,sTnI)蛋白的表达和血清中肌酸激酶(creatine kinase,CK)、 乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)和肌红蛋白(myoglobin,Mb)含量的变化。

1 材料与方法

1.1 实验动物

由第四军医大学实验动物中心提供54 只8 周龄SD雌性大鼠(体重200～220 g)，随机平均分为对照组(Con)、咬合干扰组(Exp)、咬合干扰+EDTA注射组(Exp+EDTA)(n=18)。

咬合干扰组大鼠，腹腔注射1%的戊巴比妥钠(Sigma,美国)进行麻醉，在左侧上颌第二、第三磨牙之间，及右侧下颌第二、第三磨牙之间塞入正畸皮圈(1/8，3M，美国)，以第一、第二磨牙为支抗，以皮筋的膨胀力向远中推第三磨牙移动约半个牙尖的距离(约0.8 mm)，改变双侧上下第三磨牙之间的咬合关系，确保皮筋不脱落不高于咬合平面，保持该间隙直到实验结束。对照组大鼠，将皮圈塞入后立即取出，其余实验方法同咬合干扰组。Exp+EDTA注射组大鼠，在分牙操作前将Ca2+螯合剂EDTA-Na2(90 mg/kg，Sigma，美国)溶于0.4 ml的生理盐水中，双侧咬肌皮下各注射0.2 ml，实验期间每天注射1 次。

1.2 取材和样本制备

实验后1、2、4 周分别将Con组、Exp组、Exp+EDTA注射组(每个时间点n=6)大鼠以1%的戊巴比妥钠腹腔注射深度麻醉，取腹主动脉血后处死，快速取双侧咬肌。取其中3 只大鼠双侧咬肌前中部组织，4 ℃条件下固定，脱水，石蜡包埋，切片(厚约5 μm)，苏木素-伊红染色(n=3)；取双侧咬肌后部组织，修整，4%戊二醛和1%四氧化锇分别固定2 h，丙酮梯度脱水，包埋，超薄切片后以透射电镜(JEOL，日本)观察(n=3)。取其余3 只大鼠双侧咬肌前中部组织，4 ℃条件下匀浆，加入缓冲液和溴酚蓝，80 ℃加热5 min变性，待Western blot检测；取双侧咬肌后部组织，4 ℃条件下进行匀浆，待线粒体内Ca2+含量检测。

1.3 线粒体内Ca2+含量检测

在4 ℃条件下，以组织线粒体分离试剂盒(碧云天，中国)提取咬肌线粒体，原子吸收分光光度计(日立，日本)检测Ca2+含量，BCA法进行线粒体蛋白定量，计算线粒体内Ca2+含量(n=3)。

1.4 Western blot检测

采用SDS-不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳系统(Bio-Rad，美国)、12% Laemmli分离胶电泳，以半干电转膜仪(Bio-Rad，美国)15 V转膜15 min，1%BSA+TBS封闭30 min，4 ℃一抗过夜(desmin和actin，Sigma，美国；sTnI抗体为第四军医大学航空航天医学系余志斌教授所赠[8])，耦联红外荧光二抗孵育1 h，Odyssey红外线扫描仪(Li-Cor,美国)扫描成像(n=3)。

1.5 血清学检测

动脉血室温静置1 h，4 ℃过夜，在4 ℃条件下4 000 r/min离心10 min，取上清液分装。以全自动生化仪(Roche，瑞士)检测大鼠血清中CK、LDH的含量，以ELISA试剂盒(ADL)检测血清中Mb含量(n=6)。

1.6 统计学分析

2 结 果

2.1 组织学变化

Con组大鼠咬肌组织形态正常，肌纤维横截面为圆形或多角形，细胞核位于边缘。各时间点咬合干扰组肌纤维形态基本同对照组，无明显炎性表现(图 1)。

2.2 超微结构改变

Con组大鼠咬肌肌原纤维排列整齐，线粒体大小均匀，排列整齐，嵴较多。Exp组肌纤维的部分线粒体变大变圆，基质电子密度降低，嵴断裂变短变少，甚至消失，未见肌原纤维排列紊乱，左右侧无明显差异。Exp+EDTA阻断细胞内Ca2+后，可见咬肌细胞内超微结构基本正常(图 2)。

2.3 线粒体内Ca2+含量变化

各组大鼠左右两侧咬肌线粒体Ca2+含量无明显差异(P=0.282)，各时间点Exp组线粒体内的Ca2+含量明显高于对照组(P<0.05)，而注射Ca2+阻断剂后，线粒体内Ca2+含量回落到Con组水平(P>0.05)(图3)。

2.4 骨骼肌损伤标志物检测

各时间点Exp组大鼠咬肌内的骨骼肌损伤标志物desmin和sTnI在各个时间点的表达均没有明显变化(图 4)，Exp组大鼠血清中CK、LDH和Mb与Con组间均无明显差异(图 5)。

图 1 大鼠咬肌组织切片HE染色

图 2 透射电镜观察大鼠咬肌超微结构(×10 000)

图 3 大鼠咬肌线粒体Ca2+含量

3 讨 论

目前，在骨骼肌运动损伤的相关研究中Ca2+环境失调理论是主要机制之一，骨骼肌处于不适应的运动状态下，细胞膜上的牵张性阳离子通道开放，Ca2+内流导致肌细胞内Ca2+含量增加，线粒体不仅为细胞提供能量，还可以调节细胞内Ca2+含量，当细胞内Ca2+超载时，线粒体便会摄入Ca2+，维持细胞内Ca2+的平衡。但是当线粒体内Ca2+过多时，便会影响线粒体的功能，破坏其形态，最终影响肌细胞的功能[9-10]。

图 4 大鼠咬肌中desmin 和sTnI的含量

图 5 大鼠血清中肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌红蛋白(Mb)含量

有研究表明，加高/降低动物咬合使得咬肌细胞及其线粒体内Ca2+含量增加，并出现骨骼肌损伤特征性表现，如红细胞渗出、白细胞浸润等组织学炎性变现，及线粒体肿胀、肌浆网空泡性变、肌纤维排列紊乱等超微结构的变化。Akagawa等[11]加高Wistar大鼠垂直咬合距离，观察到咬肌及颞肌前束出现组织学改变，以咬肌深层为重。祁冬等[12]在兔单侧前磨牙粘固咬合板造成咬合创伤，10 d后观察咬肌组织的超微结构和线粒体钙离子含量，发现单纯咬合创伤组出现明显的肌肉损伤改变，肌原纤维排列疏松，线粒体肿胀以及线粒体钙离子含量明显增加等表现。Bani等[13]降低大鼠单侧咬合后，观察到大鼠实验侧咬肌出现广泛的线粒体肿胀等超微结构表现，并且肌组织内钙离子含量明显增加。而给予Ca2+阻断剂后，可以抑制细胞和线粒体内Ca2+超载，并缓解超微结构损伤[14]。本研究发现，与加高动物咬合的实验结果不同，实验性牙移动引起的咬合干扰未引起大鼠咬肌组织学改变，但可以引起超微结构的改变，如部分线粒体形态变大变圆，嵴等特征性结构消失，咬肌细胞线粒体内Ca2+含量的明显增加，且注射Ca2+阻断剂可明显缓解超微结构损伤。

近来研究认为，细胞内Desmin和sTnI丢失是骨骼肌运动损伤的敏感指标[15-16]。Desmin是一种中间丝蛋白，是构成脊椎动物骨骼肌、心肌和平滑肌细胞骨架的主要成份，连接于Z线之间，限制肌节在肌肉收缩时被过分牵拉。有研究发现发现运动可导致肌细胞中desmin断裂[17]， 而细胞骨架蛋白的破坏可导致超微结构。肌钙蛋白(troponin,Tn)属于横纹肌结构蛋白，由C、T、I 3 种亚基组成，骨骼肌肌钙蛋白抑制亚基(sTnI)，是肌钙蛋白I的一种亚型，参与调节横纹肌收缩。sTnI在骨骼肌细胞中主要以结构蛋白的形式结合在肌原纤维上，当骨骼肌发生损伤后，sTnI与肌原纤维解离，进入血循环中[18]。本研究中未见肌组织中sTnI和desmin明显丢失，与电镜观察结果中超微结构损伤仅局限于线粒体形态改变，未见肌原纤维排列紊乱相印证。

肌酸激酶(CK)存在于肌肉和脑等组织的线粒体和细胞浆中，与肌细胞中能量运转和ATP再生有关；乳酸脱氢酶(LDH)广泛存在全身各组织中，特别是肌组织，与细胞内无氧糖酵解有关；肌红蛋白(Mb)仅存在于心肌与骨骼肌中。正常情况下，这3 种物质在血清中的含量非常低，但如果肌细胞发生损伤，细胞膜破裂，这3 种物质便会进入血液。大量研究表明，骨骼肌损伤即刻出现血中CK、LDH、Mb活性明显升高[19-20]。咬合干扰组大鼠的血清中未见CK、LDH和Mb含量升高，提示实验性牙移动形成的咬合干扰并不会造成咬肌细胞胞膜破裂的严重损伤。

综上，实验性牙移动形成的咬合干扰可造成大鼠咬肌轻微损伤，主要表现为超微结构变化，且与细胞内Ca2+稳态失调有关。