任明诗,丁 羽,李子涵,刘 波

(江西中医药大学药学院,江西省中医药管理局中药防治老年性疾病重点研究室，江西 南昌 330004)

破骨细胞骨吸收和成骨细胞骨形成之间的相对平衡对维持骨稳态起至关重要的作用。骨重塑阶段,成骨细胞能招募破骨前体细胞进入骨单位区域并两两接触,细胞间的信号从破骨前体细胞传递到成骨细胞,诱导成骨细胞从骨表面撤离,形成无细胞区。在成骨细胞的调控下,单核破骨前体细胞逐渐融合为多核成熟破骨细胞,分泌酸性物质和蛋白酶，分别溶解矿物质和消化骨基质的胶原纤维来进行骨吸收,并形成骨吸收陷窝。旧骨吸收后,破骨细胞产生一系列活性物质,促进成骨前体细胞迁移并募集于骨吸收处,分化为成熟成骨细胞,介导骨吸收朝骨形成的转换。在多重因子的刺激下,活化的成骨细胞在骨吸收的凹陷处大量增殖,分泌多种骨形成相关蛋白,与细胞外结晶的羟磷灰石等无机成分结合为成熟的骨基质,并逐渐矿化形成新骨。

成骨细胞能调节破骨细胞的增殖和分化,而破骨细胞也能调节成骨细胞的活性和功能。骨微环境内,成骨细胞和破骨细胞不同分化阶段产生不同活性物质,包括生长因子、细胞因子、趋化因子和微小RNA等,通过细胞与细胞直接接触或旁分泌方式,把两种细胞功能和作用紧密联系起来,协同进行平稳的骨重建活动，以维持正常的骨骼结构。近年来,局部分子信号在调节骨形成和骨吸收的作用得到广泛研究,成骨细胞和破骨细胞间的关系也引起人们的重视。本文主要介绍成骨细胞和破骨细胞产生的活性物质在细胞间相互调节的作用。

1 成骨细胞分泌的活性物质对破骨细胞功能的调节作用

成骨细胞参与破骨细胞骨吸收的功能调节。成骨细胞分泌的活性物质,如核因子κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand, RANKL)、巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor, M-CSF)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)、趋化因子CX3C配体1(chemokine CX3C ligand 1, CX3CL1)、单核细胞趋化蛋白l(monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor, IGF)、溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid, LPA)和miR-34c等,可以调节破骨细胞在骨表面附着、增殖、分化和成熟等,促进骨吸收。与此相反,成骨细胞来源的骨保护素(osteoprotegerin, OPG)、前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)、IL-18、IL-33、信号素Sema3A(Semaphorin3A)、miR-125b和miR-503等活性物质,可以抑制破骨细胞骨吸收(Tab 1)。

Tab 1 The active substances produced by osteoblasts and their effects

1.1 正向调节破骨细胞的活性物质

1.1.1RANKL RANKL是跨膜结合蛋白或游离型多肽。成骨细胞在骨吸收因子的刺激下能分泌RANKL,并与破骨前体细胞的核因子κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB,RANK)结合,从而促使破骨前体细胞分化为成熟的破骨细胞。在酸性环境下,破骨细胞的骨吸收活性增强。Okito等[1]发现酸性培养条件下成骨细胞RANKL表达水平上调。酸性环境中的成骨细胞主要功能是支持破骨细胞的形成和分化,而不是矿化。同时RANKL诱导分化的破骨细胞中存在多种趋化因子自分泌环,强化抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)阳性多核细胞的形成。

1.1.2M-CSF M-CSF是链间二硫键连接而成的二聚体糖蛋白。经骨吸收刺激因子作用,成骨细胞能分泌M-CSF。M-CSF受体c-Fms的表达仅限于巨噬细胞谱系。M-CSF与破骨前体细胞表面受体c-Fms结合,可以调节破骨细胞的增殖、分化及成熟。在破骨细胞分化的早期阶段,M-CSF可以诱导破骨前体细胞表达RANK,并通过RANKL/RANK途径促进破骨前体细胞的分化成熟,从而增强骨吸收作用。

1.1.3IL-6 白介素是糖蛋白类细胞因子。IL-4和IL-13协同IL-1能诱导成骨样细胞表达具有生物活性的IL-6。在含有IL-6培养条件下,破骨细胞的数量显著增多,成骨样细胞的碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase, ALP)活性和胶原合成被轻微抑制。IL-6和IL-6受体(IL-6R)结合促进破骨前体细胞在骨吸收处的招募,而抗IL-6R的中和抗体抑制IL-6诱导的多核破骨细胞的形成,说明成骨样细胞产生的IL-6能促进破骨细胞骨吸收。

1.1.4趋化因子 趋化因子是一类具有诱导反应细胞定向迁移作用的小分子蛋白质,主要有CXC、CC、CX3C和XC 4个亚家族。在IL-1的作用下,成骨细胞CX3CL1的表达增加,破骨细胞前体表达CX3C趋化因子受体1(CX3C chemokine receptor 1,CX3CR1),这是CX3CL1的唯一受体[2]。CX3CL1能剂量依赖性地增加破骨细胞数量和破骨细胞的形成,促进破骨细胞前体细胞向骨重构表面的归巢。敲除CX3CR1并使用特异性中和抗体对CX3CL1进行功能抑制,可减少破骨细胞生成,防止骨丢失[3]。MCP-1也是趋化因子CC亚家族中的一员。金黄色葡萄球菌感染下的人成骨细胞会分泌较高水平的MCP-1。趋化因子受体2(CC chemokine receptor 2, CCR2)在人破骨前体细胞中有明显表达,MCP-1与CCR2高选择性结合。持续的MCP-1作用将使破骨细胞过度活跃,而缺乏CCR2会导致更高的骨量。MCP-1可以诱导破骨前体细胞趋向骨重建部位,也可以促进单核破骨前体细胞募集、融合并生成破骨细胞。MCP-1基因的破坏也会导致单核破骨前体细胞在体外的迁移和募集过程受阻[4]。

1.1.5IGF IGF是一种能调控细胞增殖的多功能细胞因子,与胰岛素原的化学结构相近。在骨组织中IGF主要由成骨细胞分泌,并储存在骨基质中。IGF随着骨基质被吸收逐渐释放出来并与破骨细胞表达的IGF受体(insulin-like growth factor receptor,IGFR)结合,可以增加破骨细胞的数目和骨吸收面积。IGF-I和IGF-II是骨基质中最丰富的生长因子之一,成骨细胞产生的IGF-II比IGF-I更多,但IGF-I对破骨细胞的影响较强。在IGF-I刺激下,破骨细胞分化和功能活性迅速加强,破骨细胞形成标志物也广泛增加[5]。IGF-I基因敲除小鼠表现为较小的破骨细胞和骨吸收面积,较少破骨细胞数目和细胞核融合数,同时也促使破骨细胞成熟相关的RANKL、RANK、M-CSF和c-Fms表达水平显著下降。IGF-I一方面可能通过间接调节RANKL和RANK表达促进破骨细胞的分化,另一方面与IGFR结合直接支持单核破骨前体细胞向成熟破骨细胞的形成。

1.1.6LPA和miR-34c 成骨细胞来源的非蛋白质类的活性物质也可以促进破骨细胞骨吸收功能。LPA是一种具有强生物活性的磷脂。成骨细胞本身也能产生LPA,LPAR是破骨细胞中LPA的受体。LPA通过LPAR增强破骨细胞前体的分化,促进破骨细胞存活和融合,导致更大的破骨细胞形成[6]。miRNA是一种短小的非编码单链RNA。在BMP2刺激的成骨分化过程中,成骨前体细胞中miR-34c的表达显著升高。miR-34c转基因小鼠表现出成骨细胞增殖分化减少,破骨细胞增多。miR-34c可以使成骨细胞的OPG水平降低以增加RANKL/OPG比值,从而导致破骨细胞分化增加。过表达的miR-34c促进破骨细胞分化,而下调miR-34c表达可以抑制破骨细胞分化。miR-34c也可以通过靶向RANKL的受体LGR4,激活Gαq/GSK3-β/NFATc1信号通路促进破骨细胞分化和骨吸收[7]。

1.2 反向调节破骨细胞的活性物质

1.2.1OPG OPG属于TNF受体超家族,是肝素结合分泌型糖蛋白。成骨细胞可以分泌OPG,RANKL与OPG的亲和力比RANK更强,OPG竞争性与RANKL结合,阻止了RANKL/RANK的信号传导,抑制了破骨前体细胞的分化成熟。OPG/RANKL/RANK是成骨细胞调节破骨细胞形成和分化的经典通路。OPG缺陷小鼠破骨细胞数量增加,牙槽骨吸收严重,OPG的表达在抑制骨吸收中起重要作用。

1.2.2IL-18和IL-33 IL-18和IL-33同属于IL-1家族。内皮素-1可以诱导人成骨细胞IL-18的表达,IL-18可以和IL-18R结合抑制破骨细胞的形成,从而抑制破骨细胞性骨吸收。甲状旁腺激素可以诱导成骨细胞IL-33表达增加,IL-33通过IL-33R结合，发挥强烈抑制破骨细胞的形成作用,而IL-33R敲除可导致破骨细胞数量的增加,IL-33阻断抗体可以解除IL-33对破骨细胞形成的抑制作用。IL-33可以通过弱化RANKL或M-CSF刺激减少破骨细胞形成。M-CSF可以抑制IL-33的作用,而M-CSF中和抗体可以恢复IL-33对破骨细胞形成的抑制作用[8]。

1.2.3Sema3A Sema3A是一类重要的轴突诱向因子,是一种分泌型蛋白。成骨细胞分泌的Sema3A呈剂量依赖性的抑制破骨细胞生成。Sema3A是成骨细胞产生的一种有效的骨保护因子,可以与破骨前体细胞Plexin-A和Nrp1形成的复合物受体结合,抑制破骨细胞分化,促进成骨细胞骨形成。RANKL信号能显著下调Nrp1的表达促进破骨细胞生成,只有在RANKL刺激前加入Sema3A才能观察到破骨形成的抑制现象。所以RANKL调控的Nrp1表达紧密控制sema3A的抗破骨细胞生成功能。sema3A与Nrp1结合通过抑制ITAM和RhoA信号通路从而减弱破骨细胞分化。破坏Nrp1基因的小鼠出现骨质减少表型,而静脉注射sema3A可以加速小鼠骨再生[9]。

1.2.4PGE2前列腺素是一类具有广泛生理活性的不饱和脂肪酸,骨组织中的PGE2主要由成骨细胞分泌。PGE2通过受体EP可以抑制破骨细胞骨吸收陷窝的面积扩大和数量的增加,对分离的破骨细胞骨吸收功能有抑制作用。但也有研究表明PGE2可以促进破骨细胞形成,PGE2对成熟破骨细胞的直接作用还存在争议。

1.2.5miR-125b和miR-503 成骨细胞分泌的外泌体中含有miR-125b和miR-503。miR-125b在骨基质中储存并积累,成熟的破骨细胞骨吸收时释放骨基质中的miR-125b。miR-125b可以靶向并降解破骨前体细胞中的转录因子Prdm1来抑制其朝成熟破骨细胞方向分化。成骨细胞中过表达miR-125b的转基因小鼠表现为破骨细胞的数量减少,骨小梁骨量增加。过表达miR-125b还可以减少去卵巢或脂多糖诱导的模型小鼠骨丢失[10]。RANK是miR-503的功能靶点,miR-503可以通过抑制RANK表达阻碍破骨细胞分化。使用agomir过表达miR-503抑制了RANKL诱导的破骨细胞形成,抑制骨吸收,防止骨丢失,而使用特异性的antagomir沉默miR-503可促进破骨细胞的形成,促进骨吸收,减少骨量[11]。

2 破骨细胞分泌的活性物质对成骨细胞功能的调节作用

破骨细胞参与成骨细胞骨形成功能调节。在破骨细胞来源的活性物质中,转化生长因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)、骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)、Wnt10b、肝配蛋白B2(erythropoietin-producing human hepatocellular receptors ligand B2, ephrinB2)、基质细胞衍生因子1(stromal cell derived factor-1, SDF-1)和1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate, S1P)等可以正向调节成骨细胞的生理活动,包括促进成骨细胞的募集、成熟、分化和矿化等。相反地,肝配蛋白A2(erythropoietin-producing human hepatocellular receptors ligand A2, ephrinA2)、信号素Sema4D(Semaphorin4D)、丝氨酸蛋白酶1(high temperature requirement A1, HtrA1)、骨硬化蛋白 (sclerostin)、miR-214-3p和miR-23a-5p等可以反向调节成骨细胞的活性和功能(Tab 2)。

Tab 2 The active substances produced by osteoclasts and their effects

2.1 正向调节成骨细胞的活性物质

2.1.1TGF-β 参与骨重建的破骨细胞可以分泌TGF-β,TGF-β最初以无活性形式储存于骨基质中。当破骨细胞积极参与骨吸收时,破骨细胞分泌组织蛋白酶,从而释放并激活骨基质中的TGF-β。TGF-β可与成骨细胞膜上各个亚型的TGF-β受体(TGF-βR)结合发挥作用。TGF-β信号可以诱导成骨细胞前体细胞迁移和成熟,促使成骨细胞合成各型胶原蛋白、骨黏连蛋白和骨桥蛋白等细胞外骨基质的有机成分,并促进骨基质矿化。同时TGF-β也增强成骨细胞RANKL的表达,从而促进破骨前体细胞的募集。TGF-β对成骨细胞和破骨细胞分化具有双向作用,突出了其对骨代谢的复杂影响[12]。

2.1.2BMP BMP属于TGF-β超家族成员,是从骨基质中分离的一种活性蛋白质,BMP通过与细胞骨形态发生蛋白受体(bone morphogenetic protein receptor,BMPR)结合来发挥作用。IL-23可促使破骨细胞中成骨因子BMP2的表达。BMP2显著增加骨钙素表达,促进成熟成骨细胞的生成。BMP2/4基因敲除小鼠表现为成骨细胞的形态较小且生长缓慢,ALP活性和成骨相关基因表达减弱,矿化能力降低和严重的成骨损伤。而外源性添加的BMP2或BMP4可以使成骨细胞分化和矿化能力恢复[13]。BMP6也是破骨细胞分泌产物之一,其能增加去势大鼠的骨体积和改变骨组织力学特性,上调成骨细胞表面骨保护素、ALP和Ⅰ型胶原水平,从而恢复骨微结构和骨骼质量。

2.1.3Wnt10b Wnt10b是一种分泌型糖蛋白,也是Wnt膜蛋白受体的配体。活化的TGF-β可以刺激破骨细胞生成和分泌Wnt10b,促进成骨细胞矿化。用Wnt信号抑制剂dickkophrelated protein 1阻断Wnt10b活性,可抑制TGF-β处理的破骨细胞条件培养基促进成骨细胞矿化的能力[14]。Wnt10b的缺失小鼠导致骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)自我维持和更新的缺陷,BMSCs来源的成骨细胞活性降低,并引发后续的成骨细胞分化标志物ALP和骨钙素的表达降低以及骨小梁的骨损失[15]。

2.1.4EphrinB2 Ephrin是Eph样受体酪氨酸蛋白激酶的配体,也是膜结合型信号传递蛋白质。破骨细胞表达的ephrinB2能与成骨细胞表达的受体EphB4结合,向成骨细胞传递正向信号增强成骨分化。成骨细胞过表达EphB4可以增强小鼠成骨细胞功能,而siRNA敲低EphB4导致成骨细胞分化减少。RANKL能刺激破骨细胞ephrinB2的表达,并通过EphB4激活ERK1/2通路和减弱RhoA活性,促进下游成骨细胞成骨相关因子Runx 2和Osterix的转录,强化成骨细胞骨形成作用[16]。

2.1.5SDF-1 SDF-1也称CXCL12,属于CXC类趋化因子。破骨细胞分化或骨吸收过程中,破骨细胞向胞外分泌SDF-1 因子。BMSCs表达SDF-1的特异性受体CXCR4,SDF-1因子具有引导BMSCs迁移,分化为成熟的成骨细胞作用[17]。CXCR4在未成熟成骨细胞中表达比在成熟成骨细胞和骨细胞的表达更多。SDF-1与成骨细胞受体CXCR4结合,参与成骨细胞成骨相关蛋白表达和骨形成。CXCR4敲除小鼠表现为骨质减少,矿物附着速率减慢,成骨相关的I型胶原和骨钙素表达减少。通过siRNA、抗SDF-1的中和抗体或CXCR4拮抗剂阻断SDF-1/CXCR4通路会抑制成骨细胞分化。表明SDF-1/CXCR4信号通路通过影响成骨细胞的发育而在骨形成中发挥作用[18]。

2.1.6S1P S1P是一种具有生物活性的鞘氨醇骨架脂类分子。在成熟的多核破骨细胞中,升高的鞘氨醇激酶1能催化S1P的形成并分泌到细胞外。S1P与S1P受体(sphingosine 1-phosphate receptor,S1PR)结合诱导成骨细胞前体迁移到骨重塑位点,增强成骨细胞的存活和刺激骨形成。而S1P拮抗剂能减弱人间充质干细胞向成骨细胞分化能力,降低S1P对成骨细胞矿化结节的形成和趋化作用[19]。同时，S1P 还能够刺激成骨细胞分泌RANKL,也能间接调控破骨前体细胞的分化。

2.2 反向调节成骨细胞的活性物质

2.2.1EphrinA2 破骨细胞源外泌体表达EphrinA2,通过靶向成骨细胞膜表面的受体EphA2,引导外泌体与成骨细胞融合并释放内容物miR-214,从而发挥抑制成骨作用。EphrinA2/EphA2途径的抑制成骨分化作用可被EphrinA2蛋白的Efna2 siRNA或EphA2 siRNA缓解。抑制破骨细胞源外泌体的形成和释放，也可减弱miR-214对成骨细胞活性降低作用。nSMase和Rab27a是破骨细胞生成外泌体的两个关键蛋白,nSMase的拮抗剂GW4869和Rab27a siRNA通过减少破骨细胞源外泌体的形成和释放,可以达到减弱成骨细胞活性抑制效果[20]。

2.2.2Sema4D Sema4D是一种免疫信号素,参与多种重要生理功能的跨膜蛋白分子。破骨细胞分泌的sema4D能与成骨细胞Plexin-B1受体结合,干预IGF-1信号通路,抑制成骨细胞分化,促进骨形成向骨吸收的转化。sema4D敲除小鼠和Plexin-B1敲除小鼠的骨形成增多,出现骨硬化表型,而抗sema4D的特异性抗体能防止骨质疏松症模型小鼠的骨丢失[21]。在骨重建过程中,破骨细胞通过sema4D与Plexin-B1的结合来调控成骨细胞的迁移。sema4D诱导的接触排斥现象解释了成骨细胞和破骨细胞之间存在的空间间距,而Plexin-B1基因敲除消除了两种细胞的间距。破骨细胞可能利用sema4D介导的接触排斥作用,从而排斥成骨细胞获得骨基质来进行骨吸收[22]。

2.2.3HtrA1和Sclerostin 破骨细胞来源的HtrA1和Sclerostin都能通过拮抗BMP对成骨细胞发挥作用。HtrA属于丝氨酸蛋白酶家族,是一种分泌蛋白。HtrA1由破骨细胞分泌,作为外源性因子负调控成骨细胞分化和矿化过程,但不影响破骨细胞。HtrA1通过结合BMP2并使其失活,减少BMP2介导的成骨细胞Smad、ERK和p38磷酸化以及ALP、Runx2、骨钙素和骨桥蛋白的基因表达,从而抑制成骨细胞分化[23]。而HtrA1过表达延迟了细胞矿化进程,降低了Cbfa1和I型胶原的表达,并阻止BMP2诱导的成骨细胞矿化,siRNA沉默HtrA1的表达可以促进成骨细胞矿物沉积。Sclerostin是一种分泌型蛋白信号肽,且仅限于破骨细胞表达。Sclerostin因与BMP6和BMP7的结合具有较高的亲和力,可作为BMP的拮抗剂。Sclerostin通过抑制BMP6和BMP7活性,负调控成骨细胞的分化、功能以及骨形成,而抑制Sclerostin可能导致骨密度增加的骨硬化症。Sclerostin在破骨细胞骨吸收和成骨细胞骨附着功能中起到链接作用[24]。

2.2.4miR-214-3p和miR-23a-5p 破骨细胞源外泌体内含的miRNA是实现破骨细胞与成骨细胞之间通信的物质基础。Li等[25]发现，破骨细胞来源外泌体miR-214-3p可以转移到成骨细胞内抑制骨形成。miR-214-3p的过表达能加强对成骨细胞的活性降低作用,而阻断miR-214-3p对成骨细胞的信号传递,可以促进骨形成。miR-214-3p可以靶向ATF4成骨转录因子抑制骨形成,从而调控下游成骨相关基因表达。Yang等[26]发现，miR-23a-5p在破骨细胞的外泌体中高表达,miR-23a-5p可以抑制成骨细胞活性,可以降低成骨细胞Runx2和ALP的表达。miR-23a-5p过表达能使早期成骨减少,而miR-23a-5p抑制剂使早期成骨增加。miR-23a-5p通过调控下游通路Runx2/MT1DP影响成骨细胞分化。阻碍破骨细胞源外泌体释放，也可以减弱miR-23a-5p介导的破骨细胞对成骨细胞分化的抑制作用。

3 小结与展望

目前，这些活性物质大多属于蛋白质类,随着细胞外泌体研究领域的兴起,越来越多的miRNA类核酸物质已被证实参与成骨细胞与破骨细胞之间的交流。脂类活性成分在两种细胞之间的调控作用也引起人们的关注。赵锐等[27]总结了Runx2及其下游Osterix成骨特异性转录因子与主要成骨分化相关基因的表达密切相关,在成骨细胞分化中起关键调控作用。与成骨分化有关的重要信号通路,如BMP/Smad、Wnt/β-catenin和PI3K/AKT等,通过直接或间接方式作用于Runx2或Osterix 等关键转录因子。在破骨细胞分泌的活性物质中,TGF、BMP、wnt106、HtrA1或Sclerostin等可以通过上述信号通路间接影响Runx2的表达,而miR-23a-5p可以直接靶向Runx2发挥抑制成骨作用。SDF-1、S1P或Sema4D等可能倾向于影响成骨细胞的募集或撤离来调控骨形成的起始和终止过程。任莉荣等[28]总结了RANKL/RANK/OPG、M-CSF/C-FMS和ITAM等是破骨细胞形成和分化的经典通路,经典通路所形成的破骨细胞体积大、细胞核数量多和骨吸收凹陷深。成骨细胞来源的活性物质,如RANKL、RANK、OPG、M-CSF、Sema3A和miR-503等与上述经典通路密切相关,也存在直接作用和间接作用的区别。根据Knowles等[29]总结的破骨细胞分化的非经典通路,成骨细胞分泌的IL-6可作为RANKL的替代品,但作用弱于RANKL,而PGE2、IL-18、IL-33等炎症因子也可能通过非经典通路来发挥作用。CX3CL1和MCP-1等趋化因子主要与破骨前体细胞的定向迁移活动有关。

生理或病理条件下,成骨细胞和破骨细胞受不同刺激,产生的活性物质种类及含量也相应变化。如组织缺氧条件下,成骨细胞分泌的OPG含量显著升高,而甲状旁腺素和异丙肾上腺素刺激下,成骨细胞的RANKL和MCP-1表达上调。当然,骨疾病相关防治药物也对人体内环境产生影响,如pH、渗透压、激素和细胞因子水平的改变等,从而间接调节成骨细胞或破骨细胞产生的活性物质。近年来,越来越多的单体药物可以双向调节成骨细胞和破骨细胞活性,如淫羊藿苷、仙茅酚苷和葛根素等,经典中药及复方亦是如此,如补骨脂、女贞子、灯盏花和二仙汤、二至丸、强骨饮等。研究发现部分药物能影响成骨细胞分泌OPG、RANKL和M-CSF等活性物质,甚至外泌体的产生及其内容物miRNAs的改变。因此,药物通过调节成骨细胞和破骨细胞间偶联因子方式,来达到维持骨形成和骨吸收动态平衡目的,这引起了人们极大的研究兴趣。