王丽，权有娟，李想，刘德梅，陈志国

（1中国科学院西北高原生物研究所，西宁 810008；2青海大学，西宁 810016；3中国科学院大学，北京 100049；4中国科学院高原生物适应与进化重点实验室，西宁 810008；5青海省作物分子育种重点实验室，西宁 810008）

0 引言

小麦是世界上种植面积最大、种植时间最早、分布最广、产量最高的粮食作物之一[1-2]，也是中国主要的栽培农作物。小麦作为三大谷物之一，在田间必须要密集型种植[3]，发芽率过低会直接导致田间群体降低，不利于增产[4]。影响小麦发芽率的因素有很多，如贮存条件[5]、籽粒的发育成熟阶段、籽粒的感病情况、机械损伤、籽粒水分含量等[6]。同时，小麦种子萌发还与萌发相关酶有关[7]。种子萌发相关酶主要有α-淀粉酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶等[8]。

小麦在萌发过程中，首先是种子吸水膨胀，种子呼吸作用加剧，接着是种皮变软，胚根最先生长，突破种皮向下生长成为主根，接着是胚轴与胚芽的生长，最后形成茎和叶[9]。在种子萌发这个复杂过程中，营养物质的大量消耗是不可避免的一个过程，而萌发的种子中最主要的营养物质便是储存在胚乳中的淀粉[10]，通常需要淀粉酶将淀粉分解使之成为小分子糖类，以供种子萌发使用[11]。植物中的淀粉酶有α-淀粉酶和β-淀粉酶两种，其中α-淀粉酶是最主要的萌发相关酶[12]，可以将胚乳中的淀粉水解为糖，供胚生长[13]。

青海柴达木盆地高海拔地区具有大气干洁、光照充分、昼夜温差大等特殊生态条件[14]，近年来成为青海省东部农业区小麦良种重要的繁育基地，但在生产实践中，多次出现盆地生产的种子发芽率低，造成田间出苗差的现象，成为困扰种子生产企业的重大问题。通过青海省东部农业区海东市乐都区以及柴达木盆地都兰县香日德地区两地收获的种子进行水分、千粒重测定，和α-淀粉酶活性的测定，试图找出青海东部和柴达木盆地之间小麦种子发芽率的差异的原因。

1 材料与方法

1.1 实验材料

选用同一年份青海省海东市乐都区（海拔1956 m）和柴达木盆地都兰县香日德地区（海拔2990 m）生产的‘高原437’、‘青麦1 号’、‘高原448’、‘青春38’等4个主栽品种种子共8份材料。对这4个品种在两地收获的种子进行为期7 天的发芽实验，对α-淀粉酶的活性进行了测定。

材料准备：每个品种从刚收割脱粒的大田小麦中经过精选去除杂质后1 kg 混匀，置于室温干燥储藏。实验在青海省作物分子育种重点实验室，于2018年12月—2019年2月开展。

1.2 实验方法

1.2.1 种子水分及千粒重测定 参照GB/T 3543—1995.4《农作物种子检验规程》[15]有关标准对8 份受试材料进行千粒重测定，利用波通公司产Perten DA 7250型近红外分析仪进行水分测定。

1.2.2 发芽实验根据GB/T 3543—1995.4《农作物种子检验规程》的要求，采用TP发芽纸法[16]。将8份受试材料每份分出300 粒完整无损伤种子，置于培养皿中用75%酒精进行消毒处理30 s，处理后用蒸馏水反复漂洗3 次，再用自来水浸泡种子24 h，略微晾干，将两层发芽纸置于发芽盒(12 cm×12 cm×6 cm)内，将种子整齐均匀排列在发芽纸上，每盒放置100 粒种子（10 粒×10 粒），3 次重复。用蒸馏水（约12 mL）浸润发芽纸(12 cm×12 cm)，加盖，置于人工气候箱(25℃)内，在控温条件下发芽。置床后的第1天至第7天每日早晨统计发芽情况，计算发芽率和发芽势[17-18]，见公式(1)和(2)。

1.2.3 总蛋白含量测定采用南京建成生物工程研究所研制的BCA 法蛋白定量测试盒，利用PerkinElmer Enspire型酶标仪进行吸光值测量。

方法：准确称取0.2 g样品小麦种子，按照重量(g):体积(mL)=1:9的比例加入1.8 mL匀浆介质（0.2 mol/L，pH 7.8 的磷酸缓冲液），冰水浴条件下制备成10%的组织匀浆液，4℃，3500 r/min 离心10 min，取上清液待测。

将各样品混匀，37℃孵育30 min，波长562 nm，酶标仪测定各孔吸光度值。总蛋白浓度的计算见公式(3)。

表1 总蛋白含量测定操作表

测得10%小麦组织匀浆蛋白浓度为1.92mgprot/mL。

1.2.4α-淀粉酶(AMS)活性测定发芽实验第1～7 天，每日清晨准确称取0.2 g 小麦种子，加入匀浆介质，制备组织匀浆，4℃，3500 r/min离心10 min，取上清液，按上清液：匀浆介质=1:1稀释酶液，取稀释后酶液进行操作。采用南京建成生物工程研究所生产的淀粉酶测试盒进行α-淀粉酶活性测定。

试剂一：0.4 mg/mL底物缓冲液

试剂二：0.1 mol/L碘储备液

0.01mol/L碘应用液的配制：按照碘储备液：双蒸水=1:9稀释，现用现配，4℃遮光保存。

加样完毕后，取样200 μL 加入96 孔板，置于酶标仪下测定吸光值。α-淀粉酶(AMS)活性计算见公式(4)。

表2 α-淀粉酶活性测定操作表

1.2.5 数据处理实验所得数据采用SPSS 25.0和Excel进行统计分析。所有图片均是由Microsoft Excel 制作。

2 结果与分析

2.1 受试材料的千粒重以及水分含量的测定

在种子萌发期间吸水膨胀，水分含量对于种子的萌发存在影响：随着水分含量的下降，种子的萌发率呈升高趋势[19]，由表3知，8份受试材料千粒重在31～46 g之间，属于正常水平，由于气候条件差异，都兰地区收获的小麦种子千粒重明显高于乐都地区。8份受试材料水分均在13%以下，符合小麦贮藏规定标准，两地之间种子水分含量差异不大，说明水分不是造成地区之间种子发芽率差异的主要原因。

表3 受试材料的千粒重及水分含量

2.2 受试材料的发芽率及发芽势

种子的发芽势表示的是种子发芽的整齐度，是衡量种子品质的指标之一[20]。由表4得知，8份受试材料发芽情况各不相同，其中发芽率最高的是‘青春38’（乐都点），为96.33%。其次为‘高原437’（乐都点）、‘青麦1 号’（乐都点），分别为94.67%、92.67%。而都兰点生产的‘青麦1号’、‘青春38’、‘高原437’、‘高原448’发芽率偏低，分别为76.67%、75.33%、70.33%、31.00%。乐都点芽率最低的‘高原448’也达到了79.33%。低海拔的乐都点较高海拔的都兰点芽率差异明显。

各材料7 天内的具体发芽情况为：都兰地区收获种子，包括‘高原448’、‘青麦1号’、‘高原437’、‘青春38’在7天内整体发芽率一直呈现缓慢的增长趋势，直至发芽实验最后1 天仍然未达到正常的发芽标准，整体发芽率与对应的乐都地区的种子比较相对要低得多，尤其是‘高原448’，最后的发芽率只为31.00%。相比而言，乐都地区收获的种子，发芽情况比较一致，表现在第1天均有少量种子发芽，自第2天到第3天发芽率呈现迅猛增长，到第4天，发芽率基本达到最大值并保持平衡。

发芽势比较，‘高原448’（乐都）发芽势最高，为75.67%，其次是‘高原437’（乐都）、‘青春38’（乐都），分别为74.33%，74.00%。乐都地区发芽势普遍高于都兰地区。

实验表明，同一品种在都兰和乐都地区种子发芽率差异十分悬殊，发芽率对于小麦的群体构建具有重要的影响，也是影响小麦高产的一个重要因素之一。

表4 受试材料的发芽率

2.3 两地材料α-淀粉酶活性差异比较

α-淀粉酶是小麦萌发过程中最主要的淀粉水解酶。研究表明，α-淀粉酶活性与小麦发芽率呈极显著的相关性[21]。受试材料在发芽前1～3天，α-淀粉酶活性呈现出迅速增加趋势，至第3 天以后达到最大值并保持基本稳定（表5）。由图1 可知，在整个萌发过程中，乐都种子内的α-淀粉酶活性均呈现出略高于都兰地区种子的趋势。

经SPSS 25.0软件进行分析，本实验中8份受试材料的α-淀粉酶活性与发芽率显著相关，皮尔逊相关系数为0.641，呈显著相关性，与晏本菊[21]的研究一致。乐都地区生产的种子萌发期α-淀粉酶活性略高于都兰地区生产的种子，但是二者之间差异并不显著。

3 讨论与结论

小麦种子萌发是一个复杂而又精细的过程，小麦发芽率是小麦种子活力检测的一个常用指标[22]，也是评价小麦种子储藏劣变的一个敏感指标[23]。种子发芽率与种子的成活率密切相关，并且直接影响种子的质量[24]，关系到大田成苗。

表5 受试材料萌发期α-淀粉酶活性

本实验中对8份受试材料发芽率、水分含量、α-淀粉酶活性等指标进行了分析测定，8 份材料的水分含量均在8%左右，无明显差异，符合安全储存标准，因此排除水分含量是造成两地发芽率显著差异的原因。虽然储藏条件、真菌感染等也会对发芽率产生影响[25]，但都兰地区干燥少雨，真菌病害极轻，从籽粒表观来看，都兰产的小麦种子籽粒饱满度好，色泽亮丽，完全达到小麦良种一级要求（除芽率以外）的标准指标，所以也排除了储藏条件、真菌感染造成青海两地发芽率显著差异的原因。

通过α-淀粉酶活性测定及比较，得出乐都地区生产的种子α-淀粉酶活性略高于都兰地区的种子，但是二者之间差异并不显著，所以推测α-淀粉酶活性可能是造成两地区种子发芽率显著差异的一个方面因素。但该地区小麦生长后期常遇低温冻害，对小麦籽粒成熟度，特别是胚的成熟度有一定的影响，这可能是造成都兰地区小麦籽粒芽率偏低的另外一个原因。本研究只对小麦种子水分含量、α-淀粉酶活性进行了探讨，但发芽率的差异是多种因素作用的结果，对其他萌发相关酶以及胚的成熟度等方面的因素还需要进一步的探讨。