郭杰 王瑞雪 郝楠 王吉鸿

[摘 要]  应用单因素试验和响应面法优化超声波辅助双水相提取黑果枸杞原花青素工艺，利用BBD模型对乙醇体积分数、硫酸铵质量浓度、料液比、超声时间和超声功率等提取参数进行了优化，选取最优条件。结果表明，超声波辅助双水相提取黑果枸杞原花青素最佳工艺条件在乙醇体积分数为61%，硫酸铵质量浓度为0.24 g/mL，料液比为1∶26，超声时间为49 min，超声功率为220 W的条件下，黑果枸杞原花青素提取率达到6.113%。

[关键词]  响应面法;超声波;双水相;黑果枸杞;原花青素

[中图分类号]  TQ 914.1  [文献标志码] A  [文章编号] 1005-0310（2020）04-0085-08

Abstract： Single factor experiment and response surface methodology were used to optimize the ultrasonic assisted aqueous two-phase extraction of proanthocyanidins from Lycium ruthenicum Murr.. Five key factors including ethanol volume fraction， ammonium sulfate concentration， solid-liquid ratio， ultrasonic time， ultrasonic power were selected by one-factor-at-a-time experiments. The results showed that the optimum conditions of ultrasonic assisted aqueous two-phase extraction of Proanthocyanidins from Lycium ruthenicum Murr. were as follows： ultrasonic time for 49 min at 220 W ultrasonic power with 61% ethanol volume and 0.24 g/mL ammonium sulfate， the extraction yield of Proanthocyanidins from Lycium ruthenicum Murr. reached 6.113%.

Keywords： Response surface methodology; Ultrasonic; Aqueous two-phase extraction; Lycium ruthenicum Murr.; Proanthocyanidins

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.），茄科枸杞属多年生灌木，我国西北荒漠地区多有分布，具有极强的耐盐、耐旱、耐碱特性。因其果实中含有大量的原花青素、多糖、維生素等功能性成分[1]，具有多种有益的生物活性，被称为植物中的“软黄金”[2-3]。其原花青素的含量远高于其他天然植物，清除自由基功效是维生素C的20倍、维生素E的50倍，是自然界最有效的天然抗氧化剂[4-6]。黑果枸杞作为提取原花青素的理想植物，具有广阔的应用空间。

目前，原花青素的提取方法主要集中在有机溶剂提取法、超声波辅助提取、生物酶辅助提取等方面[7]。双水相萃取因其条件温和、提取高效、操作简单、活性损失小、无有机溶剂残留等优点，已广泛应用于各种蛋白质纯化和抗生素提取[8-9]，但关于黑果枸杞原花青素的双水相萃取工艺研究不多。本研究采用乙醇-无机盐双水相体系，用以克服传统聚合物双水相体系成本高、分离时间长、易乳化、难回收等缺点，并通过耦合超声波提高原花青素的提取率，以期为黑果枸杞原花青素工业化提取提供理论技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑果枸杞购于兰州市药材市场，自然晾干，干燥密封保存;原花青素标准品购于如吉生物科技公司;无水乙醇、硫酸铵、香草醛、无水甲醇等购于天津精细化工有限公司，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

KQ-250DE超声波清洗机：昆山超声波仪器有限公司;UV-2700紫外分光光度计：日本岛津仪器有限公司;5804R冷冻离心机：艾本德仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原花青素标准曲线的绘制

以原花青素标准品为对照，采用香草醛-盐酸法测定黑果枸杞提取物中原花青素的含量[10]。原花青素标准品甲醇溶解，分别配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL标准溶液。取各标准液1 mL依次加入6.0 mL质量浓度为40.0 mg/mL的香草醛-甲醇溶液和3 mL浓盐酸，混合均匀40 ℃避光反应30 min，甲醇为空白对照，500 nm波长处测吸光值。

1.3.2 黑果枸杞花青素的提取

黑果枸杞粉碎后过40目筛，称取1.0 g 黑果枸杞粉末于锥形瓶中，加入一定量的乙醇-硫酸铵，待形成双水相体系后，放入超声波清洗器中，在一定的超声波条件下处理一定的时间，离心，收集上清液定容形成母液。

1.3.3 原花青素提取率的测定

准确移取母液1.0 mL按1.3.1方法测定，重复3 次，取平均值，并利用标准曲线的回归方程，按式（1）计算。

黑果枸杞原花青素提取率：Y（mg/g）=C×V×dM×100%。

（1）式中，C为定容后样液质量浓度（mg/mL）;V为待测液总体积（mL）;d为稀释倍数;M为黑果枸杞样品质量（g）。

1.3.4 单因素试验

1.3.4.1 乙醇体积分数对黑果枸杞原花青素提取率的影响

准确称取1 g黑果枸杞粉末5份，分别加入体积分数为30%、40%、50%、60%、70%的乙醇，在硫酸铵质量浓度为0.25 g/mL，料液比为1∶50，超声功率为200 W，超声时间为30 min条件下萃取，每次试验重复3次，取平均值计算原花青素提取率。

1.3.4.2 硫酸铵质量浓度对黑果枸杞原花青素提取的影响

准确称取1 g黑果枸杞粉5份，分别加入质量浓度为0.15、0.20、0.25、0.30、0.35 g/mL的硫酸铵，在乙醇体积分数为50%，料液比为1∶50，超声功率为200 W，超声时间为30 min条件下萃取，每次试验重复3次，取平均值计算原花青素提取率。

1.3.4.3 料液比值对黑果枸杞原花青素提取的影响

准确称取1 g黑果枸杞粉5份，分别设置料液比为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，在乙醇体积分数为50%，硫酸铵质量浓度为0.25 g/mL，超声功率为200 W，超声时间为30 min条件下萃取，每次试验重复3次，取平均值计算原花青素提取率。

1.3.4.4 超声功率对黑果枸杞原花青素提取的影响

准确称取1 g黑果枸杞粉5份，分别设置超声功率为80、120、160、200、240 W，在乙醇体积分数为50%，硫酸铵质量浓度为0.25 g/mL，料液比为1∶50，超声时间为30 min条件下萃取，每次试验重复3次，取平均值计算原花青素提取率。

1.3.4.5 超声时间对黑果枸杞原花青素提取的影响

准确称取1 g黑果枸杞粉5份，分别设置超声时间为15、30、45、60、75、90 min，在乙醇体积分数为50%，硫酸铵质量浓度为0.25 g/mL，料液比为1∶50，超声功率为200 W条件下萃取，每次试验重复3次，取平均值計算原花青素提取率。

1.3.5 响应面试验

基于单因素实验的结果，确定了乙醇体积分数、硫酸铵质量浓度、料液比、超声功率及超声时间为工艺参数，以原花青素提取率为指标，利用Box-Behnken的中心组合试验设计原理进行实验设计，优化提取工艺，评价影响多糖得率因素的主效应、相互效应及因素的二次效应关系，实验因素与水平设计见表1。

试验数据利用完全二次多项式方程进行多元线性回归拟合，计算原花青素提取率和各实验因素之间的函数关系，见式（2）。Y=A0+3i=1AiXi+3i=1AiiXiXi+2i=13j=i+1AijXiX 。

（2）式中，Y为预测的响应值，即原花青素提取率;A0 是常数，Ai 是线性系数，Aii 是二次方系数，Aij 是交互作用回归系数;Xi是自变量。

1.4 数据统计

所有数据均表示为平均值±标准差，运用GraphPad Prism 8.0绘制实验数据相关图片，采用SPSS 18.0和 Design-Expert 8.0 数据处理系统进行统计分析，P<0.05或P<0.01表示差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 乙醇体积分数对黑果枸杞原花青素提取率的影响

由香草醛-盐酸法测定黑果枸杞提取物中原花青素含量所得的回归方程：Y=3.165 5X+0.026 5，相关系数R2=0.998 7。其中X为原花青素质量浓度，Y为样液在500 nm波长处的吸光值，该曲线在0.1～0.5 mg/mL范围内线性关系良好，适用于黑果枸杞提取液中原花青素质量浓度的计算。

乙醇体积分数对黑果枸杞原花青素提取率的影响见图1。当乙醇体积分数小于60%时，黑果枸杞原花青素提取率随着乙醇体积分数的升高呈现上升趋势;当乙醇体积分数超过60%时，黑果枸杞原花青素提取率随着乙醇体积分数的升高呈现下降趋势。这是因为原花青素溶于乙醇体系，所以开始随着溶剂乙醇体积分数的增高而上升，而乙醇体积分数过高时会引起黑果枸杞中的醇溶性物质沉淀，从而导致共沉淀现象[11]，上相中原花青素含量降低。因此，乙醇体积分数为60%时为最佳提取参数。

2.1.2 硫酸铵质量浓度对黑果枸杞原花青素提取的影响

图2表示硫酸铵质量浓度对黑果枸杞原花青素提取的影响，当硫酸铵质量浓度在0.15～0.25 g/mL范围时，原花青素提取率随硫酸铵质量浓度增大而增加，当达到0.25 g/mL时，原花青素提取率达到最高，而后，硫酸铵质量浓度再增加，原花青素提取率降低。开始时随硫酸铵用量的增加会增强双水相析相作用，提高原花青素的提取率，当硫酸铵质量浓度过高时，无机盐相增大而有机相减小，从而降低溶解于有机相中的原花青素含量[12]。因此，选硫酸铵质量浓度为0.25 g/mL为最佳的提取参数。

2.1.3 料液比值对黑果枸杞原花青素提取的影响

料液比对原花青素提取率的影响如图3所示，料液比在1∶10到1∶25的范围内，原花青素提取率随料液比的升高而增加，此后继续增加料液比，原花青素提取率不再增高。在一定范围内，溶质和溶液的接触面积随着料液比的增加而扩大，有利于原花青素的溶出[13];但料液比超过1∶25之后，细胞内外的原花青素已经达到了溶解平衡，已被充分浸提出来，考虑到提取成本，料液比选择1∶25作为原花青素提取的最佳提取参数。

2.1.4 超声功率对黑果枸杞原花青素提取的影响

在乙醇体积分数为50%，硫酸铵质量浓度为0.25 g/mL，料液比为1∶50，超声时间为30 min条件下考察超声功率对黑果枸杞原花青素提取的影响（图4）。超声功率在80 W到200 W的范围内，原花青素提取率随超声功率的升高而增加，此后继续增加超声功率，原花青素提取率增高不明显，考虑到提取成本，超声功率为200 W作为原花青素提取的最佳提取参数。

2.1.5 超声时间对黑果枸杞原花青素提取的影响

超声时间对原花青素提取率的影响见图5，提取时间在20～45 min范围内，原花青素提取率随提取时间的延长增加迅速;提取时间超过45 min以后增加趋势不明显且略有下降。其原因可能是原花青素中的羟基容易被氧化，随着提取时间延长，部分原花青素氧化分解[14]，所以在超过45 min后原花青素提取率会略有所下降。因此，选45 min为黑果枸杞原花青素最佳的提取时间。

回归模型的拟合极显著（P<0.000 1），实验复相关系数（R2）是0.891 8和校正测定系数（R2adj）是0.805 2，以上结果均表明模型拟合程度高可靠性强，观察值和预测值之间的相关性良好，在实验变量范围内具有很高的显著性，可用该模型来分析和预测原花青素的提取条件，此外，低变异系数（cv）为7.11%表示模型的精度高。以上分析结果证实选用的试验方法准确可靠，可以用此回归方程对试验结果进行分析和预测。表3的结果显示模型的一次项E极显著，D显著;二次项A2，B2，C2， E2极显著。所选的各因素水平范围内，超声功率对原花青素提取率的影响最为显著。

根据多元回归方程做出不同处理因素对黑果枸杞原花青素提取率的影响相应的三维响应面和二维等高线如图6、图7所示。三维响应面阐释了当其他因素保持在零水平不变时，因变量之间的关系和两个测试变量之间的相互作用[15]，二维等高线图的形状反映了变量之间的交互效应，圆图表示试验参数相互作用影响不显著，而椭圆轮廓图表示试验参数相互作用影响显著[16-17]。由图6（a）、图7（a）观察可知，乙醇体积分数和硫酸铵质量浓度交互作用显著，硫酸铵质量浓度轴向等高线密集且变化趋势陡峭，乙醇体积分数轴向等高线较稀疏且变化平缓，表明硫酸铵质量浓度比乙醇体积分数对原花青素提取率的影响显著;图6（b）、6（c）、6（f）和6（h）结果表明，乙醇体积分数与料液比、乙醇体积分数与超声时间、硫酸铵质量浓度与超声时间、料液比与超声时间交互作用不显著;但从整体二维等高线图曲面的变化趋势分析，超声功率显著影响花青素提取率，这一结果与方差分析结果一致。

2.2.2 最优工艺条件及验证实验

利用Design-Expert 8.0软件分析优化黑果枸杞原花青素提取的最佳条件：乙醇体积分数为61.2%，硫酸铵质量浓度为0.243 5 g/mL，料液比为1∶25.85，超声时间为48.58 min，超声功率为215.6 W。最佳条件下黑果枸杞原花青素预测最高提取率为6.147 7%。为检验预测结果的可靠性，兼顾实际操作的便利性，将上述最佳提取条件修正为乙醇体积分数为61%，硫酸铵质量浓度为0.24 g/mL，料液比为1∶26，超声时间为49 min，超声功率为220 W进行重复实验。3次平行试验实际测得黑果枸杞原花青素提取率为6.113±0.142%，证实了预测值和实验值之间的良好相关性，表明该模型适用于黑果枸杞原花青素的提取。

3 结束语

本研究利用响应面法优化超声波辅助双水相提取黑果枸杞原花青素的工艺参数，在乙醇体积分数为61%，硫酸铵质量浓度为0.24 g/mL，料液比为1∶26，超声时间为49 min，超声功率为220 W的条件下，黑果枸杞原花青素提取率达到6.113%，而赵文娟等人应用传统醇提工艺提取黑果枸杞原花青素提取率为4.315%[18]，本研究方法明显高于赵文娟等人的提取工艺。以上结果表明超声波辅助双水相法是一种可靠高效的原花青素提取方法。

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（责任编辑  李亚青）