俞博浩 张德勇

【摘  要】为分析微塑料（MPs）与三氯生（TCS）两种污染物联合暴露对普通小球藻的毒性效应，首先通过单独染毒实验证实了MPS、TCS均会抑制藻类的增殖速度，其96h-EC50值分别为95.85和17.46 mg/L，且检测到叶绿素含量、抗氧化酶活力、可溶性蛋白含量下降及MDA含量升高。联合染毒实验进一步证实了MPs与TCS复合暴露时仍会出现上述毒性效应，但各指标的联合毒性普遍低于单独染毒的效应加和值，即呈现出一定的拮抗效应。另外，不同剂量组的比较显示，当染毒物质剂量提高后，这种拮抗效应通常会有所减弱。

【关键词】微塑料（MPs）;三氯生（TCS）;普通小球藻;复合暴露;毒性效应

微塑料（MPs）指直径小于5 mm的塑料碎片、颗粒及纤维，因其体积小而易于进入生物体内[1]。塑料的使用已有100多年历史，近年来微塑料几乎在世界各地的水域被检测到。据分析，北太平洋副热带环流中微塑料的数量高达32.76个/m3和250 mg/m3[2]。我国渤海海岸微塑料达103-163个/kg，海水浴场等人类活动频繁的地区尤其高。除了海洋，在淡水生态中也发现了微塑料，我国太湖表层水中丰度可达3.4-25.8个/L，沉积物中的微塑料为11-235 个/kg[3]。三氯生（TCS）则是一种化工产品，作为杀菌剂被广泛添加于纺织品、洗衣粉、除臭剂、护肤品和个人卫生用品中。TCS长期被大量生产和应用，全世界年使用量估计在750×103吨以上。生物降解和光降解不足以高效清除TCS，加上其强亲脂性，使得TCS在环境中的浓度不断上升，并在生物体内逐渐富集。目前，环境中已经普遍污染有TCS，国内外陆续有在环境中检出TCS的报道[4]。MPs与TCS已经成为当前水环境中比较常见的两种污染物，甚至在各级生物的体内也普遍检测到了它们的存在，因此它们对生态系统的威胁一直是备受关注的热点环境问题，其生态毒性值得深入研究。

藻类是水生生态系统中的初级生产者，处于食物链底端，评价MPs和TCS对藻类的毒性效应可以为全面认识其生态危害提供很好的切入点。尽管有少量报道证实MPs对藻类的毒性可表现为可抑制细胞生长、破坏细胞膜结构、降低叶绿素含量和光合效率、引起细胞氧化损伤等，且毒性大小与微塑料本身的种类、大小、浓度等有关[5-7]。但总体而言，当前关于MPs、TCS的毒性效应及其机制的研究尚不够系统，针对藻类的研究尤其不足。且当前研究绝大多数采用了MPs单独染毒方式，获得的结果远远不能反映实际环境中MPs因和其他污染物共同存在可能导致的复合效应。为分析MPs与其他污染物联合暴露对淡水藻类具有何种效应并初步揭示其产生机制，本研究拟评价不同剂量的MPs与TCS联合染毒后，对普通小球藻的增殖、光合作用、抗氧化能力等方面的毒性效应及其与单独染毒的差异。

1 材料与方法

1.1 藻类培养及染毒方案

普通小球藻（Chlorella vulgaris）购自中科院水生所;培养基为水生4号;培养条件为25℃、12h/12h光暗循环[8]。染毒实验中，MPs设计了1.34、11.47 mg/L两个剂量，TCS设计了0.077、0.230 mg/L两个剂量，然后按照下文中表1所示的方案，进行单独与联合染毒，染毒后继续培养96h然后分析各指标。

1.2 藻类生物量的光密度分析法的建立

首先对藻液进行全波长扫描，找出特征吸收峰。然后分别利用吸光度法与显微镜计数法建立藻浓度与吸光度值之间的回归方程。

1.3 藻类的生长抑制效应分析及96h-EC50值计算

基于A690值绘制生长曲线，建立抑制率P和浓度的自然对数LnC的线性回归关系，求解抑制率为50%的浓度值即EC50值。抑制率P（%）=（对照组A690-处理组A690）/对照组A690

1.4 藻类的叶绿素含量测定

藻液用高速离心法提取，加1.5mL乙醇和少许石英砂研磨，转入离心管定容到10mL，于4℃黑暗提取12h;4000rpm离心10min;上清于比色管中用90%乙醇定容10mL。于比色皿中，测吸光值。叶绿素a浓度（mg/L）=（11.64A633+2.16A645+0.10A630）V1/1000V2。式中V1为提取液定容体积（mL）;V2为滤液体积（L）。

1.5 抗氧化酶活性测定

1.5.1 SOD活性测定

收集藻细胞，研磨、离心，取上清为SOD粗提液。采用邻苯三酚自氧化法测定SOD活力，再按照2.35mL Tris-HCl缓冲液、1.8mL蒸馏水、0.15mL邻苯三酚溶液、200μL样液的反应体系测定ΔA325。U=[（A325-ΔA325）/ΔA325×100%]/50%×Vs×D/V总。

1.5.2 POD活性测定

藻细胞破壁后，上清充分转入25mL容量瓶定容。取比色皿加入反应混合液3 mL和酶液1 mL。立即开启秒表记录A470，每隔1 min读数1次，共5 min。U=（A470×0. 01×W ×t）×样品稀释倍数。

1.5.3 CAT活性测定

藻细胞破壁后，加入3mL0.05mol/L pH7.8 PBS，再加入200μL 30%H2O2迅速摇匀，1分钟后开始，每1 min记录1次A240，连续记录5min。U=ΔA240×Vt/W/Vs/0.01/t。

1.6可溶性蛋白含量测定

取4mL藻液，离心后沉淀重悬于10?L Loarding buffer，煮沸10 min，离心取上清，SDS-PAGE电泳分析蛋白表达。另外，取破壁离心后的上清于1 cm光程石英比色皿中测定A280值和A260值，按公式计算可溶性蛋白含量。

1.7 MDA活性测定

藻液离心后加10%TCA研磨，匀浆液12000rpm离心10min。取2mL上清于试管，加入0.6%硫代巴比妥酸2mL，沸水浴10min。4500rpm离心10min，取上清測吸光度。MDA浓度=6.45（A532-A600）-0.56×A450。

1.8 统计分析

采用SPSS软件的单因素方差分析法（One Way ANOVA）分析处理组与对照组之间的差异显著性，p<0.05为显著。

2 结果

2.1藻类生物量的光度分析法的建立

连续波长扫描显示，普通小球藻在690 nm处有较明显的吸收峰，可用于建立藻类生物量的分析方法;故基于藻液的密度与其A690值之间的规律性建立了线性回归方程：y=0.025x+0.0403;R?=0.9613。二者具有较理想的线性关系，可用于快速测定藻类生物量。

2.2 MPs、TCS染毒对普通小球藻的增殖速度的影响

如图1所示，MPs及TCS单独染毒对小球藻均有抑制效应，其96h-EC50值分别为95.85 mg/L和17.46 mg/L。联合染毒则均呈现为拮抗作用，即MPs+TCS联合染毒引起的抑制率小于单独染毒的抑制率之和。

2.3 MPs、TCS染毒对普通小球藻叶绿素含量的影响

各组的叶绿素含量结果为：阴性对照组1.367 mg/L、M1组0.148 mg/L、M2组0.572 mg/L、T1组0.847 mg/L、T2组0.843 mg/L、M1T1组0.549 mg/L、M1T2组1.028 mg/L、M2T1组 0.681 mg/L、M2T2組0.698 mg/L。因此，MPs、TCS单独染毒均导致了小球藻叶绿素含量下降。4个联合染毒组的降幅（依次为0.818、0.339、0.686、0.669 mg/L）均小于相应的单独染毒组的加和值（依次为1.739、1.743、1.315、1.319 mg/L），故联合效应主要表现为拮抗效应。

2.4 MPs、TCS染毒对普通小球藻抗氧化酶活性的影响

单独染毒下三种物质对藻类的抗氧化酶活性均有抑制效应（p<0.05）。联合效应可通过比较联合染毒组的抑制值与单独染毒组的抑制值进行比较判断（表1）。如表1所示，对于SOD活力，4个联合染毒组的抑制值分别为7.732、9.181、8.215、10.148 U/g，均小于相应的单独染毒组的加和值（依次为10.148、13.047、12.081、14.980 U/g）;对于POD活力，4个联合染毒组的抑制值分别为0.402、0.454、0.418、0.485 U/g，均小于相应的单独染毒组的加和值（0.671、0.720、0.695、0.744 U/g）;对于CAT活力，4个联合染毒组的抑制值分别为36、40、36、48 U/g，均小于相应的单独染毒组的加和值（32、52、48、68 U/g）;因此对于3种抗氧化酶，联合染毒组的抑制值均小于单独染毒直接相加之和，故MPs与TCS联合染毒时对抗氧化酶的抑制效应均呈现为拮抗效应。

2.5 MPs、TCS染毒对普通小球藻可溶性蛋白含量的影响

各组的可溶性蛋白含量结果为：阴性对照组1.169 mg/mL、M1组1.064 mg/mL、M2组0.928 mg/mL、T1组0.614 mg/mL、T2组0.731 mg/mL、M1T1组0.534 mg/mL、M1T2组0.674 mg/mL、M2T1组 0.629 mg/mL、M2T2组0.752 mg/mL。MPs和TCS染毒均导致小球藻的可溶性蛋白含量下降。4个联合染毒组的降幅（依次为0.635、0.495、0.540、0.417 mg/mL）均小于相应的单独染毒组的加和值（依次为0.660、0.543、0.796、0.680 mg/mL），故联合染毒均表现为拮抗效应。

2.6 MPs、TCS染毒对普通小球藻MDA含量的影响

各组的可MDA含量结果为：阴性对照组0.295 mg/mL、M1组0.993 mg/mL、M2组1.179 mg/mL、T1组0.932 mg/mL、T2组0.883 mg/mL、M1T1组0.467 mg/mL、M1T2组0.877 mg/mL、M2T1组0.733 mg/mL、M2T2组0.191 mg/mL。MPs和TCS染毒普遍导致小球藻的MDA含量升高。4个联合染毒组的升幅（依次为0.172、0.582、0.438、-0.104 mg/mL）均小于相应的单独染毒组的加和值（依次为1.335、1.286、1.521、1.472 mg/mL），故联合染毒均表现为拮抗效应。

3讨论

当前MPs、TCS已成为引人关注的重要污染物。水中的MPs会被生物误以为浮游生物而主动对其进行捕食，从而进入生态系统的食物链。研究发现许多水生动物的胃、消化管、肌肉等组织和器官中均含有微塑料存在。近来甚至在人体内也普遍检测到了微塑料的存在，且种类多达数十种。TCS也被国内外众多研究者证实对许多生物具有的毒性效应，且影响的器官系统不一而足，包括生殖毒性、内分泌干扰效应、肝肾毒性、免疫系统毒性、DNA损伤与遗传毒性等[9-11]。藻类是水生生态系统的生产者，MPs对藻类的影响关系到整个水生生态系统的维系。在本研究中，MPs被证实能抑制普通小球藻的增殖，并引起叶绿素含量、抗氧化能力等的下降等，这一结论与与以往在其他藻类上的研究报道基本一致（虽然以往某些研究称观察到同时促进和抑制藻类生长的所谓“双重效应”，但属于个例，在本研究所采用的普通小球藻上未观察到此情况）。同时，与以往研究不同，本研究更侧重于考察MPs与其他污染物联合暴露时呈现的毒性效应。除了叶绿素指标有点例外，在所研究的绝大多数指标中，我们均证实了MPs、TCS联合暴露时，会呈现一定的拮抗效应，即联合毒性低于两种物质单独暴露引起的毒性之和。这一现象以往罕有探讨，初步分析其原因可能是MPs具有较强的吸附性和漂浮性，导致其他污染物能被吸附在其颗粒上而无法发挥对藻类的毒性。另外，结果也显示当染毒剂量双双升高时，拮抗效应往往有所减弱。

本研究在评估藻类的状态采用了叶绿素、抗氧化状态、蛋白表达、可溶性蛋白含量几个重要指标。叶绿素是光合作用的执行者，测定叶绿素含量可以了解植物物质转化的程度和速度，其含量高低直接反映藻类的生长繁殖能力。从本研究的结果看，MPs和TCS对叶绿素含量有严重的影响，虽然联合染毒有一定的拮抗效应，但对于缓解这种毒性效应实际意义不大。藻类的抗氧化能力的强弱与健康程度存在着密切联系，抗氧化酶的活力有助于大致藻类的健康状况。为了充分评估普通小球藻的抗氧化状态，分别测定了3种抗氧化酶的活力。其中SOD是负责清除氧自由基的酶，POD藻类体内负责分解过氧化物的酶，CAT是能够催化过氧化氢分解为水和分子氧，这三者均是藻类抗氧化损伤、清除代谢废物的关键物质，对藻类的生长代谢非常重要。从本研究的结果看，MPs和TCS对小球藻的三种抗氧化酶均有显著影响，可导致其活性显著降低。单独染毒组引起SOD活力的降幅在4.349-7.732 U/g，联合染毒组引起的降幅在7.732-10.148 U/g范围;单独染毒组引起POD活力的降幅在0.283-0.412 U/g，联合染毒组引起的降幅在0.402-0.485 U/g范围;单独染毒组引起CAT活力的降幅在16-36 U/g，联合染毒组引起的降幅在36-48 U/g范围。可溶性蛋白质有助于藻类对抗环境胁迫，还能增加细胞渗透浓度和功能蛋白的数量，有助于维持细胞正常代谢，因此也是反映抗逆状态的指标。在本研究中，低剂量的MPs对可溶性蛋白产生的毒性效应微小，但POFS结合后则会产生协同作用，大大增强TCS对可溶性蛋白的毒性。MDA是膜脂过氧化作用的最终分解产物，其含量反映藻类遭受逆境伤害的程度。MPs在本研究被证实对藻类的细胞膜能够造成严重危害，并且在MPs与TCS联合染毒中对MDA含量存在着协同作用。这进一步增强了染毒物对藻类细胞膜的破坏。

本研究的结果显示，水体中多种污染物同时存在时，其联合效应非常复杂和微妙。如微塑料虽然对藻类有明显的毒性，如破坏其光合作用、损害其抗氧化能力、影响某些生化分子的浓度等，但同时也可能在一定程度上减缓了其他污染物的毒性。当然，本研究仅仅是对联合毒性效应的初步探索，其中涉及的具体分子机制尚待进一步揭示，例如微塑料与其他污染物的拮抗效应是通过何种机制发生的？是仅仅由于物理性的吸附，还是涉及到某些化学变化？微塑料与其他污染物相结合及解离的规律性是怎样的？诸多问题值得进一步探讨。

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作者简介：

俞博浩，2000年6月出生，男，汉族，浙江舟山人，本科生，研究方向为生物工程。

通讯作者：

张德勇，1978年4月出生，男，汉族，山东聊城人，博士生，教授，研究方向为毒理生态学。

基金项目：

本研究受浙江树人大学实验室开放项目（2021JS3012）资助