王春燕　任彩霞　任向东　关志涵　柳春洋　乌恩其　牛世祯　李洪亮

摘 要：超高温灭菌乳（UHT乳）在货架期内发生的品质劣变主要是由产品中残存的内源和（或）外源耐热蛋白酶、脂肪酶水解内容物发生的一系列物理、化学变化引起的。本文综述了引发超高温灭菌乳货架期品质劣变的主要蛋白酶及其作用原理，并就未来研究方向进行展望。

关键词：超高温灭菌乳（UHT乳）;货架期品质;蛋白酶

Abstract：The deterioration of UHT milk during its shelf life is mainly caused by a series of physical and chemical changes， due to the residual endogenous and / or exogenous heat-resistant proteases and lipase hydrolysates of the product. This review discussed the major proteases that cause the deterioration of UHT milk during its shelf life and the mechanisms of their function， and pointed out the future research of the field.

Key words：UHT milk; Shelf life quality; Proteases

中图分类号：TS252.1

超高温灭菌乳（UHT乳）是以生牛（羊）乳为原料，添加或不添加复原乳，在连续流动的状态下，加热到至少132 ℃并保持很短时间的灭菌，再利用无菌包材经无菌灌装等工序制成的液体产品。目前，市场销售的纯牛乳主要是巴氏杀菌乳和UHT乳两大类，巴氏杀菌乳由于热处理强度较低（72～75 ℃处理15～20 s），一般只杀灭乳中致病菌而残留一定量的乳酸菌、酵母菌和霉菌;而UHT乳热处理强度相对较高（135～150 ℃处理2～8 s），可以杀死乳中几乎所有微生物（包括病原体、非病原体、芽孢等），且利用无菌包材进行无菌灌装，因此具有常温储存、携带方便、易于保存与货架期长等优势，非常适合我国目前冷链不健全、运输半径大等的市场消费需求。不仅中国，全球范围内对超高温加工和无菌包装牛奶的需求也正在增长。对于许多发展中国家和热带国家而言，UHT乳是液体乳制品的最佳选择，因为它不需要低温物流和存储，并且具有相对较长的保质期（≥6个月），这些特征在乳制品出口国际贸易中具有明显的商业开发优势。

目前，企业对UHT乳产品感官品质的重要评价指标有色泽、滋气味和组织状态[1]，优质液态乳产品在货架期内的品质要求见表1。

尽管UHT乳市场广阔，但其在货架期内经常发生一些品质劣变，如蛋白水解、苦味、老化凝胶、脂肪上浮、风味劣化等。影响UHT乳质量的因素有很多，其中来源于原料乳本身的纤维蛋白溶酶（Plasmin）及来源于原料乳中嗜冷菌的耐热蛋白酶（Protease）对牛乳蛋白的水解作用是影响UHT乳品质的重要因素。虽然UHT先进的加工工艺与设备可杀死原料奶中几乎所有的微生物而保证其产品的生物安全性，但无法在热处理过程中将体细胞和一些细菌释放的耐热酶完全灭活，正常情况下会残留20%～40%的酶活[2]。残留的耐热酶将在产品货架期内缓慢水解乳蛋白、脂肪等成分，导致产品出现老化凝胶、苦味、脂肪分层、风味劣化等质量缺陷，对消费者健康及企业品牌造成巨大的不良影响[3]。

1 影响UHT乳货架期品质的蛋白酶及其作用机理

1.1 纤维蛋白溶酶系统及其作用机理

1.1.1 纤维蛋白溶酶系统

牛奶中的内源酶已经被研究了100多年，到目前为止，已经从牛奶中鉴定出约70种酶[4]，这些酶具有不同的特异性、稳定性和对产品质量的影响[5]。

牛乳中的纤维蛋白溶酶是一个复杂的酶系统，包含纤维蛋白溶酶（PL）、纤维蛋白溶酶酶原（PLG）、纤维蛋白溶酶酶原激活剂（PA）、纤维蛋白溶酶酶原激活剂抑制剂（PAI）以及纤维蛋白溶酶抑制剂（PI）。其中，牛乳纤维蛋白溶酶（EC3.4.21.7）是一种丝氨酸蛋白酶，其最适pH为7.5，最适温度为37 ℃。纤维蛋白溶酶酶原是纤维蛋白溶酶在乳中的主要存在方式，是非活性形式，可被组织型（tPA）或尿激酶型（uPA）纤维蛋白溶酶酶原激活剂激活。鲜乳中的纤维蛋白溶酶酶原浓度為0.18～2.8 mg·L-1，是纤维蛋白溶酶（0.1～0.7 mg·L-1）的2～30倍。此外，该系统还受纤维蛋白溶酶和纤维蛋白溶酶酶原激活物抑制剂的调节，如图1所示。

据报道，该酶系统与奶牛乳腺健康相关，即与体细胞计数（SCC）有关[6-7]，这是由于纤维蛋白溶酶酶原激活剂uPA通过uPA受体与体细胞结合[8]，并且在体细胞裂解时释放，并与酪蛋白胶束结合，该酶系统中的纤维蛋白溶酶、纤维蛋白溶酶酶原和纤维蛋白溶酶酶原激活剂tPA也主要与酪蛋白胶束结合[9];纤维蛋白溶酶抑制剂和纤维蛋白溶酶酶原激活剂抑制剂存在于乳清相。

纤维蛋白溶酶系统具有很高的热稳定性，尤其是促进蛋白水解的PL、PLG和PA，在UHT处理后可以保持部分活性。因此，纤维蛋白溶酶系统与UHT牛奶的物理化学降解密切相关[10]。

1.1.2 纤维蛋白溶酶水解酪蛋白机理

纤维蛋白溶酶在牛乳微观结构中与酪蛋白胶束底物结合，主要作用于β-酪蛋白（β-CN）和αs2-酪蛋白（αs2-CN），在较小程度上水解αs1-酪蛋白（αs1-CN），但对κ-酪蛋白和乳清蛋白几乎没有水解作用，且在直接UHT灭菌乳中纤维蛋白溶酶对酪蛋白的水解作用更为明显，货架期内纤维蛋白溶酶对直接UHT灭菌乳中αs1-CN、αs2-CN和β-CN的水解产物信息分别如图2～4和表2～4所示（Q值>1 400的肽具有潜在苦味）[11]。

UHT乳的老化胶凝现象被认为是牛奶热处理过程中κ-CN与变性β-lg络合引起的。UHT乳储存期间，该复合物的持续释放和聚集可能导致凝胶化。据推测，通过水解酪蛋白将复合物锚定在酪蛋白胶束表面，蛋白水解可促进κ-CN-β-lg复合物的释放[12]。

1.2 嗜冷菌耐热蛋白酶及其作用机理

1.2.1 嗜冷菌耐热蛋白酶

除了纤维蛋白溶酶外，来源于细菌的耐热蛋白酶对UHT乳货架期品质也可能是一个严重威胁，因为这些细菌在生奶中是不可避免的，其中有些细菌在低温储运时产生的耐热的蛋白酶和脂肪酶可以承受UHT热强度过程。在所有的细菌中，假单胞菌产生的耐热蛋白酶是导致UHT奶失稳的最重要因素[13]。在假单胞菌属中已经发现了一种属于AprX酶家族的胞外碱性金属蛋白酶，这是造成牛奶变质的原因[14]。据报道，热稳定蛋白酶是假单胞菌在细菌生长初期或指数晚期产生的，通常此时细菌数为107～108 CFU·mL-1[15]。这意味着AprX的产生取决于储运时间、温度和原奶假单胞菌的数量。因此，AprX水平间接反映了农场的卫生管理情况和牛奶的储运历史。Lei Yuan等[16]对中国11个城市共16个牧场的原奶进行细菌菌群分离鉴定，并对这些微生物在不同贮存温度下产生的耐热酶特性进行了深入研究[17]，其研究结果显示，从中国11个城市共16个牧场中共分离得到涵盖24个菌属的76株嗜冷菌，其中有48株菌具有蛋白酶活性，分离得到的25株假单胞菌都具有蛋白酶活性，并且荧光假单胞菌所产生的蛋白酶是76株菌中活性最高的。

1.2.2 嗜冷菌耐热蛋白酶水解作用机理

AprX不仅可以像凝乳酶一样水解κ-酪蛋白的肽键Phe105-Met106[18]，而且可以非特异性地水解通常在可溶性亲水性糖巨肽周围呈现为“毛状层”的区域[19]。因此，胶束表面亲水尾部的裂解会减少空间排斥力和静电排斥力，这可能会促进凝胶网络的形成[14]。另外，水解β-和αs-酪蛋白的能力（即使程度低于纤维蛋白溶酶的程度）也可能破坏酪蛋白胶束的内部，进一步促进胶凝的形成[20]。

张春月研究团队还发现，与纤维蛋白溶酶不同，牛乳产品在AprX的作用下粒径尺寸分布向较大尺寸转移，这可能是因为AprX可以较容易地水解κ-CN，一旦足够量的κ-CN水解（超过95%），颗粒之间的碰撞将导致黏附和酪蛋白聚集体的形成[20]。κ-CN的氨基酸序列如图5所示。

1.3 总结

UHT乳货架期内品质劣变（苦味、凝胶、沉淀）是由嗜冷菌耐热蛋白酶和纤维蛋白溶酶共同引起的，与纤维蛋白溶酶相比，嗜冷菌蛋白酶能够以与凝乳酶相似的方式水解κ-CN，且嗜冷菌蛋白酶表现出更多的非特异性蛋白水解模式，通常会产生溶解性小肽，产生的副酪蛋白胶束聚集形成粗且硬的凝胶;而纤维蛋白溶酶水解产生较大的非溶解性衍生肽，产生的凝胶软且细。乳品中蛋白质凝胶老化模型如图6所示。

当嗜冷菌耐热蛋白酶和纤维蛋白溶酶同时存在时，纤维蛋白溶酶对牛乳蛋白的水解作用更占优势，因此，与间接UHT杀菌工艺相比，使用直接UHT杀菌工艺时，与纤维蛋白溶酶相关的老化胶凝发生更频繁，会产生细而软的凝胶，且凝胶可以悬浮在乳清中;而对间接UHT杀菌工艺的灭菌乳来说，引发产品凝胶和沉淀的主要原因是嗜冷菌耐熱蛋白酶对酪蛋白的水解作用，产生的粗而硬的凝胶不能悬浮在乳清中而是沉淀在容器底部[23]，如图7所示。图7（a）中，B为空白对照，即正常灭菌乳，未添加酶;aprX为添加20 μg·mL-1 AprX的灭菌乳;PL为添加1.6 μL·mL-1纤维蛋白溶酶的灭菌乳。图7（b）为含20 μg·mL-1 AprX和1.6 μL·mL-1纤维蛋白溶酶的胶凝样品倒置图像。

引起发UHT乳老化凝胶的第一个关键因素是蛋白的水解度。张春月研究团队发现，含ApX和纤维蛋白溶酶的样品发生凝胶的蛋白质水解的临界水平分别为1.3%和2.1%，与酶浓度或储存温度无关[20]。第二个影响因素是UHT乳的储存温度。在低温（<20 ℃）储存下凝胶化缓慢，在20～25 ℃加速，>30 ℃下不会发生凝胶或凝胶发生延迟，这是由于贮藏温度>30 ℃条件下，纤维蛋白溶酶的蛋白水解速度大于多肽聚集的速度，无法形成凝胶[23]。因此，为避免UHT乳在货架期内发生品质劣变，应从这两个关键因素着手进行控制。

蛋白水解度与原奶质量（嗜冷菌和体细胞数量及储运温度和时间）密切相关，提高牧场环境卫生，并保障原奶低温短时储运是降低产品蛋白水解度的源头保障，选择合适的杀菌工艺平衡、活性营养成分保留和微生物/酶灭活是过程保障;最终产品的储运温度是终端保障。只有源头、过程、终端节节把关，才能保障灭菌乳产品在货架期内的品质。

2 展望

随着优质乳工程在行业内的深入推行，企业对灭菌乳产品品质升级的需求已经受到前所未有的重视，为使终产品营养价值得到最大限度提高，企业不断在提升原奶品质和优化加工工艺方面做出巨大努力，如删减不必要的工艺环节带来的设备闲置损失和/或重新设定合理工艺参数增加的设备改造成本;此外，企业还面临着工艺优化（热处理强度降低）后带来的终产品货架期品质安全风险，如微生物和酶的灭活效率降低而带来的品质劣变及货架期缩短。

因此，未来超高温灭菌乳货架期品质的研究方向重在源头、过程、终端。①源头，即如何进行牧场管理，保障原奶品质达到优质乳工程条例中明确规定的不同等级原料乳标准。②过程，即如何选择合适的杀菌工艺，以达到平衡活性营养成分保留和保障货架期品质的微生物/酶灭活的效果。③终端，即终产品储运温度及在该温度下的存放时间。3个宏观研究方向又包含多个微观研究焦点，包括微生物、体细胞、酶、蛋白质水解等。这需要各高校、研究机构和乳品企业密切配合，相互支持，只有将灭菌乳生产全链条研究透彻，才能科学合理的运用到实际生产中，将本土生产的牛奶打造成为真正的优质奶。

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