王雅婷 兰丽珍

摘要 目的：研究葛根芩連汤治疗糖尿病性骨质疏松大鼠的效果及机制。方法：雌性SD大鼠60只，随机均分为3组。对照组20只无处理，余40只腹腔注射链脲佐菌素35 mg/kg，建立大鼠糖尿病模型。葛根芩连汤组：按生药量10 g/kg葛根芩连汤灌胃，模型组同法以0.9% NaCl灌胃，持续灌胃12周。行大鼠空腹胰岛素水平（Fins）、空腹血糖（FBG）、胰岛素敏感指数（ISI）及素抵抗指数（HOMA-IR）检测。RT-PCR、Western Blot检测椎体BMP-2/Smad表达变化，进一步行骨密度、骨钙含量及生物力学性能测定及HE染色。结果：模型组素HOMA-IR，FBG水平较对照组均升高，Fins及ISI降低（P<0.05）。葛根芩连汤组大鼠HOMA-IR，FBG水平与模型组比较降低，Fins及ISI均升高（P<0.05）。模型组大鼠椎体BMP-2、Smad1、Smad4基因和蛋白的表达较对照组降低（P<0.05）。葛根芩连汤组大鼠椎体BMP-2、Smad1、Smad4基因和蛋白较模型组升高（P<0.05）。模型组大鼠骨密度、骨钙含量、极限载荷、极限应力和弹性模量较对照组降低（P<0.05）;葛根芩连汤组大鼠骨密度、骨钙含量、极限载荷、极限应力和弹性模量与模型组比较升高（P<0.05），HE染色示葛根芩连汤治疗后大鼠骨质疏松减轻。结论：葛根芩连汤在降低DOP大鼠血糖水平，减轻胰岛素抵抗，通过调高BMP-2/Smad通路发挥治疗大鼠DOP的作用。

关键词 葛根芩连汤;糖尿病;空腹胰岛素水平;空腹血糖;大鼠;骨质疏松;通路;机制

Abstract Objective：To study the efficacy and mechanism of Gegen Qinlian Decoction（GQD）in the treatment of diabetic osteoporosis rats. Methods：A total of 60 female SD rats were randomly divided into 3 groups. The control group did not receive any treatment， and the remaining 40 were intraperitoneally injected with streptozotocin 35 mg/kg once to establish a rat model of diabetes. GQD group：According to the crude drug amount 10 g/kg， GQD was intragastrically administered to the rats. The model group was intragastrically administered with 0.9% NaCl for 12 weeks， and the rats， fasting insulin level（Fins）， fasting blood glucose（FBG），insulin sensitivity index（ISI）and hormone resistance index（HOMA-IR）were detected. RT-PCR and Western Blot were used to detect the expression of BMP-2/Smad pathway in vertebral body， and the bone mineral density， bone calcium content， biomechanical properties and HE staining were further determined. Results：Compared with the control group， the HOMA-IR， the FBG level in rats of model group increased， and the Fins and ISI decreased（P<0.05）.Compared with the model group， the HOMA-IR， the FBG level decreased， and the Fins and ISI were increased in the GQD group（P<0.05）.Compared with the control group， the expression of BMP-2，Smad1，Smad4 gene and protein expression in the vertebral body of the model group was significantly lower（P<0.05）.Compared with the model group， the expression of BMP-2，Smad1，Smad4 gene and protein expression in the vertebral body of the GQD group were significantly increased（P<0.05）.Compared with the control group， the bone mineral density， bone calcium content， ultimate load， ultimate stress and elastic modulus of the model group were significantly lower（P<0.05）.Compared with the model group， the bone mineral density， bone calcium content， ultimate load， ultimate stress and elastic modulus of the GQD group were significantly increased（P<0.05），HE staining showed that osteoporosis was alleviated in rats after treatment with Gegen Qinlian decoction. Conclusion：GQD can reduce the blood glucose level of diabetic osteoporosis rats and alleviate insulin resistance， and may play a role in the treatment of diabetic osteoporosis by increasing the BMP-2/Smad pathway.

Keywords Gegen Qilian decoction; Diabetes; Fins; FBG; Rat; Osteoporosis; Pathway; Mechanism

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.12.010

2型糖尿病（Type 2 diabetes，T2DM）约占糖尿病总病例的90%，它引起多种并发症，目前对于心血管和神经、肾脏及外周血管的相关研究最多，但是其对机体的影响和破坏性不止如此，临床和基础研究表明2型糖尿病的内分泌和代谢紊乱影响骨骼形成和代谢[1-2]，临床表现为2型糖尿病患者常同时伴有骨质疏松症，如何对糖尿病骨质疏松症（Diabetic Osteoporosis，DOP）进行有效的干预和治疗为目前破待解决的问题，最好是对2型糖尿病及骨质疏松具有治疗效果且不良反应小的药物或方案[3-4]。传统中药方剂葛根芩连汤（Gegen Qinlian Decoction，GQD）对2型糖尿病有显著的治疗效果[5]，同时有研究显示葛根对治疗骨质疏松亦有治疗效果[6]，故本研究以糖尿病骨质疏松症（DOP）大鼠模型为研究对象，探讨葛根芩连汤对DOP大鼠的疗效和可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康SD大鼠60只（康宝生物，山西），雌性，SPF级，8周龄，体质量体质量210～240 g，大鼠生产许可证号码：SCXK（晋）2015-0003，饲养于山西医科大学实验动物中心，使用许可证号码：SYXK（晋）2015-0004。湿度50～60%，温度22～25 ℃，自然昼夜交替，自由饮水饮食。实验过程符合国家及本地相关实验动物的法规。

1.1.2 药物 链脲佐菌素（美国Sigma公司，货号：S0130），葛根、炙甘草、黄连、黄芩（由北京同仁堂太原分店提供）。

1.1.3 试剂与仪器 双能X线骨密度仪（法国GK公司，型号：CHAILENGE），体质量计（美国GE公司：型号：ZH6632）、BMP-2（批号：ab14933）、β-actin（批号：ab8245）、Smad1、Smad4（批号：ab202445）兔抗大鼠多克隆抗体、HRP山羊抗兔IgG（批号：ab6721）购于英国Abcam公司，由上海生工合成相关引物，Bradford蛋白浓度测定试剂盒（碧云天公司，批号P0006）、RT-PCR试剂盒（碧云天公司，批号：D7153），Trizol（北京嘉美纽诺生物科技公司，批号：tr118），Western blot电泳仪（美国BIO-RAD公司，型号：1645050-OG）。

1.2 方法

1.2.1 建立DOP大鼠模型及分组 经1周适应性饲养后，对照组不做任何处理，余40只，腹腔注射链脲佐菌素35 mg/kg 1次，建立大鼠糖尿病模型，监测血糖2周，检测血糖值和血清胰岛素值，随机血糖值≥16.7 mmol/L同时表现为对胰岛素抵抗，符合2型糖尿病大鼠模型[7]。建模成功后分为模型组及葛根芩连汤组，20只/組。

1.2.2 给药方法 按生药量10 g/kg葛根芩连汤灌胃，模型组同法以0.9% NaCl灌胃，持续灌胃12周。葛根芩连汤按《伤寒论》步骤制备：取葛根250 g、黄芩150 g、黄连150 g、炙甘草100 g，用10倍质量的水分别对各中药20 min浸泡，先煎葛根，水沸后煎煮20 min，加入其余已侵泡的药汤继续煎至40 min，滤过后，残渣中加8倍量的水，煎煮30 min，把2次滤过的汤剂混合，调整全方生药量2 g/mL，浓缩水煎液后备用。

1.2.3 检测指标与方法 1）空腹血糖、血清胰岛素和HOMA-IR及ISI检测：治疗12周后，每组大鼠眼眶取血，电子血糖仪测量FBG，取大鼠主动脉血，采用ELISA法，行各组大鼠血浆胰岛素水平测定。按公式：FBG×Fins/22.5计算HOMA-IR。按公式：1/（FBG×Fins）计算ISI。2）测定骨密度及骨钙含量：于治疗后的12周，每组随机选大鼠5只，以颈脱臼法处死，在无菌条件下将大鼠的左侧股骨取出后，于股骨中点进行标记后，分别进行右侧股骨中点、近端及远端骨密度检测。CHAILENGE骨密度仪测定并记录结果。取右侧股骨在支架上固定，手术刀将股骨上附着的组织剔除干净后，通过原子吸收法对其骨钙含量进行测定。3）股骨生物力学检测及HE染色：于治疗后的12周，每组随机选大鼠5只，以颈脱臼法处死，大鼠固定于支架上，取出大鼠股骨，将股骨上上附着的组织剔除干净后，通过三点弯曲实验对股骨进行生物力学测试，将股骨置于试验机上测试，跨距设置17 mm，加载速度2.0 mm/min，按结果描绘应力-应变曲线。10%的甲醛对股骨固定后，行组织切片;经梯度酒精脱水，行石蜡包埋，行4～5 μm连续切片，脱蜡后，经HE染色，行光学显微镜观察。4）BMP-2、Smad1、Smad4基因表达检测：将每组剩余大鼠予以颈脱臼处死，取椎体组织100 mg，液氮冷冻后研磨，Trizol法提取大鼠椎体组织总RNA，测定总RNA含量后，RT-PCR两步法将mRNA逆转录为cDNA，BMP-2上游引物：5′-GGAC TGCGG TCTCCTAAA-3′，下游引物：5′-CA GCCTC AA CTCAAACTCG-3′，产物长度为191 bp;Smad1上游引物：5′-GCAGCACCTACCC TCAC-3′，下游引物：5′-AACCATCCACCAACACG-3′，产物长度为306 bp;Smad4上游引物：5′-CACT ATGAGCGGGTTGT-3′，下游引物：5′-TGTCCTTCCGTGGGTAA-3′，产物长度为137 bp;内参β-actin上游引物：5′-CCACCATGTACCCAGGCATT-3′，下游引物：5′-AGGGTGTAAAACGCAGCTCA-3′，产物长度为253 bp。PCR反应条件如下：于94 ℃条件下变性，1 min，于60 ℃温度下退火，退火时长30 s，72 ℃延伸延伸1 min，共45个循环。5）BMP-2、Smad1、Smad4蛋白表达检测：将提取后的剩余物按1 500 r/min，离心半径8 cm，离心30 min后，取上清为粗体蛋白，BCA法行蛋白浓度测定。每组取样品蛋白40 μg，10%的ADS-PAGE凝胶电泳（70 V，30 min;95 V，90 min），蛋白电泳分离，通过半干法将蛋白电转于硝酸纤维素膜。5%脱脂牛奶室温封闭2 h;然后加入相应一抗BMP-2、Smad1、Smad4鼠单抗（1∶500）、β-actin鼠单抗（1∶800）4 ℃孵育过夜。PBS将未结合的抗体洗去，加入二抗羊抗兔IgG（1∶800）孵育1 h，洗去未结合蛋白，经ECL发光显色后，照相后，Quantityone软件行灰度值分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据处理，计量数据以均数±标准差（±s）表示，多组间比较行单因素方差分析（One-way ANOVA）及q检测，2组比较通过LSD-t法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组FBG、Fins、HOMA-IR及ISI水平 模型组素HOMA-IR，FBG水平较对照组均升高，Fins及ISI较对照组均降低（P<0.05）。葛根芩连汤组大鼠HOMA-IR，FBG水平与模型组比较均降低，Fins及ISI与模型组比较均升高（P<0.05）。见表1。

2.2 骨密度及骨钙含量测定 12周后，模型组股骨BMD及骨钙含量较对照组明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）;葛根芩连汤组股骨的BMD和骨钙含量较模型组显著升高（P<0.05）。见表2。表明葛根芩连治疗能够有效地提高糖尿病骨质疏松症大鼠BMD和骨钙含量，发挥治疗作用。

2.3 生物力学性能的变化 12周后，三点弯曲实验检测生物力学性能检测模型组极限载荷、极限应力和弹性模量明显低于对照组（P<0.05），葛根芩连汤组的极限载荷和弹性模量比模型组有显著增高（P<0.05）。见表3。

2.4 HE染色结果 在治疗后的第12周后，模型组可见骨小梁出现断裂，变稀疏，小梁排列紊乱，间隙扩大。葛根芩连汤组骨小梁窄较之减轻，部分骨小梁较粗，骨小梁排列较之规则、间隙增小于模型组，对照组骨可见组织结构完整，未见骨小梁断裂，稀疏和排列紊乱。见图1。

2.5 各组BMP-2/Smad基因表达影响 模型组大鼠椎体组织BMP-2、Smad1、Smad4基因表达较对照组显著降低（P<0.05）。葛根芩连汤组大鼠椎体组织BMP-2、Smad1、Smad4基因表达较模型组显著升高（P<0.05）。见图2、图3。

2.6 各组BMP-2/Smad蛋白表达影响 模型组大鼠椎体组织BMP-2、Smad1、Smad4蛋白表达较对照组显著降低（P<0.05）。葛根芩连汤组大鼠椎体组织BMP-2、Smad1、Smad4蛋白表达较模型组显著升高（P<0.05）。见图4、图5。

3 讨论

骨质疏松症是糖尿病的一种常见并发症，但在发生骨折前并没有其他症状，DOP主要的发病机制是机体的骨重建失衡，包括破骨细胞数量增多导致的骨吸收加速和成骨细胞检索导致的骨形成减少[8-9]。流行病学研究中，糖尿病患者表明骨质疏松性骨折的风险与一般人群比较升高，与非糖尿病患者和血糖控制良好的糖尿病患者比较，血糖控制欠佳的糖尿病患者骨折风险增加了47%～62%[10]。然而，导致糖尿病骨质疏松的潜在分子机制仍不清楚，如何有效的对DOP进行治疗是目前研究的热点，目前多数研究关注点在中药配方及其成分对骨质疏松症的影响[11]。

本研究我们探讨葛根芩连汤对DOP大鼠的影响。古人多用葛根芩连汤治疗湿热所致的痢疾、腹泻等。现代基础及临床研究证实其对于各科疾病均有治疗作用[12-13]。葛根芩连汤具有消渴作用，临床研究证实其能降低糖尿病患者的血糖及血脂，对2型糖尿病有一定疗效，基础研究表明其哪个降低多种动物模型的血糖[14]，同时大量研究显示葛根及其提取物能够对骨质疏松发挥治疗作用，葛根的功能成份主要以葛根甙类化合物、异黄酮类化合物及三萜皂苷为主，异黄酮类化合物为天然性植物性雌激素，对骨质疏松有治疗作用，且具有着不良反应低的特点。钟伟权等研究表明葛根提取物能够有效的提高骨密度，升高血清骨转化指标，能够促进老年骨质疏松患者骨折愈合，具有較高的应用价值[15-16]。

本研究将葛根芩连汤用于DOP大鼠治疗，结果显示，模型组素HOMA-IR，FBG水平较对照组均升高，Fins及ISI均降低。葛根芩连汤组大鼠HOMA-IR，FBG水平与模型组比较均降低，Fins及ISI均升高。这些结果均证明葛根芩连汤可对糖尿病骨质疏松大鼠具有降低血糖，减轻胰岛素抵抗的治疗作用，从根本上改善了大鼠机体内环境，为缓解糖尿病骨质疏松症状提供条件，进一步研究表明在改善大鼠血糖及胰岛素水平后，与模型组比较，葛根芩连汤组大鼠骨密度、骨钙含量、极限载荷、极限应力和弹性模量明显升高。研究结果表明了大鼠骨质疏松得以改善，骨密度及钙含量升高，生物力学性能得以提高，分子生物学进一步研究表明与模型组比较，葛根芩连汤组大鼠大鼠椎体组织BMP-2、Smad1、Smad4基因和蛋白的升高，HE染色示葛根芩连汤治疗后大鼠骨质疏松减轻。从此结果可以推断，葛根芩连汤可能通过调控调高BMP-2/Smad通路，发挥对骨质疏松的治疗作用，为DOP治疗提供新的思路。

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（2019-10-22收稿 责任编辑：王明）