（绵阳市人民医院 妇科，四川 绵阳 621000）

宫颈癌是威胁全球女性健康的最大疾病之一，宫颈癌患者的发病率与病死率居高不下[1]。宫颈上皮内瘤变是在临床中并未确诊为原位癌的宫颈异常增殖性病变，其长期存在可能发展为宫颈癌[2-3]。宫颈上皮内瘤变暴露在阴道微环境内，而阴道微环境中的菌群具有保护阴道微环境的作用。目前对阴道菌群在宫颈上皮内瘤变发生、发展中具有一定作用仍有争论。本研究重点探讨宫颈上皮内瘤变患者阴道菌群分布情况，对指导临床宫颈病变筛查与治疗提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2017年1月—2019年1月在绵阳市人民医院妇科就诊的180 例宫颈病变患者，分为宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia,CIN）I级88 例（CIN I组）和CIN Ⅱ/Ⅲ级92 例（CIN Ⅱ/Ⅲ组）。纳入标准：①经宫颈液基细胞学与宫颈活检病理确诊为CIN I级和/或Ⅱ/Ⅲ级；②年龄22 ～60 岁；③性生活≥3年，但近3 d 内无性生活史；④自愿参与本研究，并签署知情同意书。排除标准：①合并免疫缺陷、全身系统性疾病；②糖尿病、激素治疗性疾病；③月经不规律；④近1 周内见异常阴道分泌物及阴道流血；⑤妇科检查患有细菌性阴道病、毛滴虫阴道炎及外阴阴道假丝酵母菌病。选取同期本院体检的健康女性75 例作为对照组。本研究通过医院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂及仪器

DNA 试剂盒（德国Qiagen 公司），细菌培养基（广州市珠海迪尔生物工程有限公司）。ABI-2720 PCR仪（美国ABI 公司），Illumina Miseq 测序平台（美国MiSeq 公司）。

1.3 方法

1.3.1 标本采集采用无菌棉拭子深入阴道后选取后穹隆位置缓慢转动10 ～15 s 后，待棉拭子充分吸收分泌物后取出，置入干燥无菌试管中。标本采集后存放于-80℃冰箱，用于细菌基因组DNA 的提取。

1.3.2 细菌基因总DNA 提取参考文献[4]采用DNA 试剂盒提取样本中总DNA，按照说明书进行操作，成功提取DNA 后存放于-20℃冰箱中。

1.3.3 16S rRNA V3、V4 区的PCR 扩增与IlluminaMiseq测序参考文献[5]引物对照，采用PCR 扩增法（北京线上生物科技有限公司）将基因组DNA 稀释并进行提取后，进一步使16S rRNA 的V3、V4 区基因片段系数放大，同时采用双末端展开序列测试。具体采用的引物片段参考文献[6]。正向引物：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'，长 度338 bp；反向引物：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'，长度806 bp。经PCR 反应后，取得缓冲液5×FastPfu 4μl，构成成分包含dNTPs 2.0μ1，FastPfu 聚合酶0.4μl，正反向引物各0.8μl，模板0.5μl，无菌去离子水11.5μl。反应条件：95℃预变性3 min，95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，共计27 个循环，72℃继续延伸10 min，储存于4℃环境中，将PCR 产物等量混合后检测样本标签序列，由上海派森诺医学检验所完成。革兰染色检测乳酸杆菌属、加德纳菌属、奇异菌属及其他菌属。采用培养法进行厚壁菌门、放线菌门及其他21 个菌门鉴定。

1.4 观察指标

观察各组Alpha 多样性指数评估（菌种丰度指数Chao、ACE）、菌种多样性指数（Simpson 指数与Shannon 指数）、微生物群菌落门及微菌群分布情况。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析，进一步两两比较用SNK-q法；计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验，进一步两两比较用χ2分割法，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组Alpha 多样性变化

对照组、CIN I组和CIN Ⅱ/Ⅲ组Simpson 指数、Shannon 指数比较，经方差分析，差异无统计学意义（P＞0.05）；而Chao、ACE 比较，差异有统计学意义（P＜0.05），CIN I组较对照组、CIN Ⅱ/Ⅲ组高（P＜0.05），且CIN Ⅱ/Ⅲ组高于对照组（P＜0.05）。见表1。

2.2 各组菌门结构

本研究总共测出23 个菌门，对照组、CIN I组和CIN Ⅱ/Ⅲ组厚壁菌门、放线菌门及其他21 个菌门构成比比较，经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=40 176.180，P=0.000）。对照组与CIN I组厚壁菌门、放线菌门及其他21 个菌门构成比比较，差异有统计学意义（χ2=15 894.568，P=0.000）；对照组与CIN Ⅱ/Ⅲ组厚壁菌门、放线菌门及其他21 个菌门构成比比较，差异有统计学意义（χ2=28 239.622，P=0.000）；CIN I组与CIN Ⅱ/Ⅲ组厚壁菌门、放线菌门及其他21 个菌门构成比比较，差异有统计学意义（χ2=25 889.547，P=0.000）。见表2。

2.3 各组菌群类型

对照组、CIN I组和CIN Ⅱ/Ⅲ组阴道乳酸杆菌属、加德纳菌属、奇异菌属及其他菌属构成比比较，经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=79 286.753，P=0.000）。对照组与CIN I组阴道乳酸杆菌属、加德纳菌属、奇异菌属及其他菌属构成比比较，差异有统计学意义（χ2=188 665.755，P=0.000）；对照组与CIN Ⅱ/Ⅲ组阴道乳酸杆菌属、加德纳菌属、奇异菌属及其他菌属构成比比较，差异有统计学意义（χ2=14 952.312，P=0.000）；CIN I组与CIN Ⅱ/Ⅲ组阴道乳酸杆菌属、加德纳菌属、奇异菌属及其他菌属构成比比较，差异有统计学意义（χ2=28 097.984，P=0.000）。见表3。

表1 各组Alpha 多样性变化比较 （±s）

表1 各组Alpha 多样性变化比较 （±s）

注：†与对照组比较，P＜0.05。

组别 n Chao ACE Simpson 指数 Shannon 指数对照组 75 47.54±23.14 53.02±24.17 0.69±0.18 0.70±0.58 CIN I组 88 65.02±24.51† 84.14±27.01† 0.55±0.22 1.02±0.71 CIN Ⅱ/Ⅲ组 92 60.02±29.27† 71.02±28.02† 0.78±0.21 0.69±0.68 F 值 10.290 27.790 1.630 0.101 P 值 0.001 0.001 0.105 0.920

表2 各组菌门结构比较

表3 各组菌群类型比较

3 讨论

宫颈癌是现阶段病因明确的恶性妇科肿瘤，与高危型人乳头瘤病毒持续感染有一定关系，但其进展为宫颈癌的潜伏期长，所以在潜伏期临床及早发现可以逆转。目前，临床对宫颈病变进展的因素尚未统一，但有研究发现，阴道菌群结构改变与宫颈病变相关[7]。

国内外相关报道发现，女性阴道微环境菌群构成具有一定的规律性，但其不稳定的变化发展与宫颈病变表现出相关性[8-9]。临床研究发现，健康女性的阴道菌群绝大多数为厚壁菌门，乳酸杆菌属同样占比较高，而加德纳菌、奇异菌属等丰度不高[10]。阴道微环境处于平衡状态时为菌群提供寄居，常见为革兰阳性需氧菌、兼性厌氧菌及革兰阴性需氧菌等，该类菌群主要聚集于阴道侧壁黏膜皱褶与穹隆中，极少部分在宫颈位置聚集。既往研究在女性阴道分泌物中分离出50 多种不同的菌群，而健康女性阴道中以乳酸杆菌为主[11]。女性阴道微环境菌群构成处于平衡状态时，具有预防病原体侵袭的功能，而确保阴道菌群环境平衡的pH值是由乳酸杆菌、雌激素来调节[12]。乳酸杆菌可调控阴道微环境的平衡，同时还可以分泌大量乳酸杆菌预防致病菌群侵袭，提高阴道局部抵御感染、肿瘤等疾病。研究还发现，乳酸杆菌可活化为细胞外糖类包裹病原菌侵袭宫颈上皮细胞形成生物膜，避免病原菌进一步发展[13]。本研究结果发现，CIN I组乳酸杆菌菌属（53.50%）低于对照组（62.76%）和CIN Ⅱ/Ⅲ组（72.01%），从而反映阴道微生物菌群环境均衡性发生变化，可能会造成CIN 进展，而CIN Ⅱ/Ⅲ组乳酸杆菌高于对照组（72.01% VS 62.76%）。本研究中，CIN I组乳酸杆菌属含量下降，通常阴道菌群中的乳酸杆菌具有维持阴道微环境平衡、抑制病原菌生长，提高阴道局部抵御感染的作用。乳酸杆菌可形成空间性占位从而保护宫颈上皮细胞，避免病原菌黏附，减少病原菌黏附与感染。CIN I组乳酸杆菌属含量降低提示阴道菌群平衡紊乱导致阴道微环境发生变化，宫颈上皮感染高危型人乳头瘤病毒的易感性风险较高[14]。本研究结果与既往研究结果趋于一致，CIN I组加德纳菌属（19.16%）高于对照组（14.11%）和CIN Ⅱ/Ⅲ组（12.16%）；同时CIN I组奇异菌属丰度同样高于对照组和CIN Ⅱ/Ⅲ组。加德纳菌属可作用于CD59 调节分子活化炎症信号通路，大量释放细胞溶解素，造成阴道上皮细胞凋亡从而减少乳酸杆菌定植，阴道微环境失衡的风险升高。本研究说明宫颈病变与奇异菌丰度关系密切。COOREVITS 等[15]研究基于3D 培养条件，分析阴道上皮细胞模型同样证实了奇异菌可增强炎症反应，改变阴道微环境；同时还发现奇异菌的丰度升高可能预示着其影响宫颈上皮内细胞。

综上所述，从女性阴道菌群的构成发现不同宫颈上皮内瘤变患者阴道菌群丰度变化与宫颈病变具有一定的关联。