（阆中市人民医院，四川 阆中 637400）

急性肝损伤（acute liver injury,ALI）是指肝脏疾病发展至功能衰竭的中间环节。我国是肝病高发国家，其中感染为主要病因，由此导致的脂多糖血症是造成肝功能损伤的重要因素[1]。在疾病进展中，内毒素可使机体炎症反应失控，大量的炎症因子和效应细胞相互激活，引起肝细胞弥漫性坏死[2]。如果不能得到有效控制，可引发肝纤维化、肝硬化甚至是脏器衰竭危及患者生命，但目前ALI 的病理机制尚未完全阐明[3]。有学者报道肝损伤与高迁移率族蛋白B1（high modility groupbox 1,HMGB1）活化有关，HMGB1 能够进一步激活Toll 样受体4（Toll like receptor4,TLR4）、核因子κB（nuclear factor kappaB,NF-κB）通路，通过大量释放炎症介质，引起肝损伤[4]。有研究发现阻断HMGB1 信号，能有效抑制四氯化碳诱导的肝损伤小鼠肝脏细胞凋亡[5]，但未有明确报道证明HMGB1/TLR4/NF-κB 信通路对脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）诱导大鼠ALI 的保护作用。作为常用中药材，决明子具有清肝明目的功效，在临床广泛使用，有研究发现，决明子有效成分为蒽醌类化合物[6]。有研究显示决明子总蒽醌通过对肝细胞增殖与凋亡的影响，促进肝组织再生修复[7]。近期有学者报道决明子总蒽醌能够抑制NF-κB 通路蛋白的表达，降低炎症反应[8]。本研究通过复制LPS 诱导的ALI 大鼠模型，探讨决明子总蒽醌对大鼠肝脏的作用机制，为临床提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物SPF 级8 ～10 周龄的SD 雄性大鼠60 只，体重200 ～220 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[实验动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0011]。依照阆中市人民医院实验动物管理办法，室温下标准饲料、自由饮水、分笼（4 笼）适应性饲养1 周。动物实验操作均经医院实验动物管理伦理委员会批准（批准号：2019-032）。

1.1.2 主要试剂LPS 购自美国Sigma 公司，决明子总蒽醌由本实验室提取（批号：20180624），BCA 蛋白测定试剂盒、DAB 化学发光试剂盒购自南京建成生物有限公司，HMGB1、TLR4 及NF-κB 抗体购自德国Rebstock 公司，肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor α,TNF-α）、白细胞介素-6（Interleukin 6,IL-6）、白细胞介素-1β（Interleukin 1β,IL-1β）试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.1.3 主要仪器LIOOS600T 生物显微镜购自日本尼康公司，凝胶成像系统购自美国Bio-Rad 公司，-80℃超低温冰箱购自德国维根斯公司，RM2135 组织切片机购自德国Leica 公司，高速低温离心机购自北京六一仪器厂。

1.2 模型复制和分组

大鼠均适应性喂养7 d，随机分为对照组、模型组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组12 只。除对照组外其余各组大鼠尾部静脉注射5 mg/kg LPS 复制ALI 模型，注射剂量0.5 ml；对照组给予同等体积的生理盐水[9]。低、中、高剂量组大鼠在模型复制后每日分别给予灌胃1 次10 mg/kg、20 mg/kg 及40 mg/kg的决明子总蒽醌，灌胃剂量5 ml，连续给药14 d；对照组和模型组给予等体积生理盐水。

1.3 血清生化指标检测

实验第15 天清晨抽取大鼠空腹尾部静脉血，4℃、5 000 r/min 离心10 min，取上层血清，4 h 内采用全自动生化仪检测各组大鼠肝功能指标，包括丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransfease,ALT）、总胆红素（total bilirubin,TBIL）及天门冬氨酸基转移酶（aspartate aminotransferase,AST）。

1.4 HE 染色观察肝组织病理变化

采血后引颈处死大鼠，沿腹中线切开腹壁，暴露腹腔组织，小心分离肝脏，采用10%多聚甲醛固定24 h 后切片，HE 染色后光镜下观察其病理改变。

1.5 TUNEL 染色检测各组大鼠肝组织中的细胞凋亡

从冰箱中取出10%大鼠肝组织，常规方法固定，冷冻切片，二甲苯浸洗2 次，梯度酒精浸洗5 min，风干后用3%双氧水-甲醇浸泡10 min，PBS 漂洗3 次，3 min/次。采用4℃乙醇预冷的0.1% TritonX-100、0.1%缓冲液处理2 min，PBS 漂洗3 次，3 min/次，加入TUNEL 反应混合液，加封口膜在暗湿盒中反应1 h，温度37℃。采用PBS 漂洗，二甲苯处理并用中性树脂封片后，显微镜下观察各组大肝细胞凋亡情况。

1.6 ELISA 检测TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平

取肝脏组织并用匀浆器打碎，4℃、8 000 r/min离心15 min，收集上清液，采用ELISA 试剂盒检测肝组织中TNF-α、IL-6 和IL-1β 水平，严格按照试剂盒说明书步骤进行，用酶标仪记录光密度值，并根据标准曲线计算各因素水平。

1.7 Western blotting 检测HMGB1、TLR4 及NF-κB蛋白

取大鼠部分肝组织，加入RIPA 组织裂解液，匀浆器打碎，4℃、8 000 r/min 离心10 min，取上清液提取总蛋白并定量。在蛋白样品中加入上样缓冲液，然后在95℃或更高温度下变性10 min。将样品加入SDS-PAGE 胶样品孔中。膜转移后用2% BSA 密封过夜。用TBST 清洗4 次后，在4℃条件下用一级抗体孵育过夜，TBST 清洗4 次后，将二级抗体在37℃条件下孵育1 h，TBST 清洗4 次，反应30 s 后显影，在成像系统进行曝光和图像采集，并以GAPDH 作为内参蛋白计算蛋白相对表达量。

1.8 统计学方法

数据分析采用SPSS 16.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 决明子总蒽醌对ALI 大鼠肝功能的影响

各组ALT、AST 及TBIL 水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组较对照组升高（P＜0.05），中、高剂量组较模型组下降（P＜0.05）。决明子总蒽醌对ALI 大鼠肝功能的保护具有剂量依赖性。见表1。

表1 各组ALT、AST 及TBIL 水平比较 （n=12，±s）

表1 各组ALT、AST 及TBIL 水平比较 （n=12，±s）

注：①与对照组比较，P＜0.05，②与模型组比较，P＜0.05。

组别 ALT/（u/L） TBIL/（μmol/L） AST/（u/L）对照组 42.30±6.49 9.05±3.42 142.26±15.63模型组 240.68±9.27① 43.49±2.71① 343.55±16.54①低剂量组 234.12±7.59 41.92±2.32 340.46±14.63中剂量组 154.41±5.06② 24.40±3.25② 238.72±13.85②高剂量组 88.98±4.81② 14.51±3.01② 201.82±12.61②F 值 153.232 182.532 128.458 P 值 0.000 0.000 0.000

2.2 决明子总蒽醌对ALI 大鼠肝脏的影响

对照组大鼠肝脏细胞结构完整，清晰可辨；细胞整齐排列，细胞间质无水肿，肝脏横纹清晰且规则。模型组大鼠肝脏细胞肿胀且排列不规则；细胞间质水肿明显及细胞外基质增多，可见较多炎症细胞浸润，成纤维细胞增多。低剂量组大鼠肝脏细胞排列更加紊乱，部分核膜破裂、消失，可见部分细胞胞膜缺失，细胞呈现凋亡状态，肝脏细胞间质充血严重，肝脏横纹消失，出现炎症细胞浸润。与模型组相比，中、高剂量组大鼠肝脏细胞较模型组排列规则，炎症细胞浸润明显减少，肝脏细胞损伤症状明显减轻，细胞凋亡状态明显改善，并呈剂量依赖性。见图1。

2.3 决明子总蒽醌对ALI 大鼠肝脏细胞凋亡的影响

对照组、模型组、低剂量组、中剂量组及高剂量组肝细胞凋亡率分别为（12.76±1.39）%、（79.26±6.97）%、（75.51±4.22）%、（61.41±2.48）%和（47.87±8.29）%，经方差分析，差异有统计学意义（F=56.384，P=0.000）；模型组较对照组升高（P＜0.05），中、高剂量组较模型组下降（P＜0.05）。决明子总蒽醌对ALI 大鼠肝细胞凋亡的抑制作用具有剂量依赖性。见图2。

图1 决明子总蒽醌对ALI 大鼠肝脏的影响 （HE×200）

图2 决明子总蒽醌对ALI 大鼠肝脏细胞凋亡的影响 （TUNEL 染色×400）

2.4 决明子总蒽醌对ALI 大鼠IL-1β、IL-6 和TNF-α 的影响

各组肝组织中IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组较对照组升高（P＜0.05），中、高剂量组较模型组下降（P＜0.05）。决明子总蒽醌对ALI 大鼠肝脏炎症因子水平的抑制作用具有剂量依赖性。见表2。

表2 各组肝组织中IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平比较 （n=12，pg/ml，±s）

表2 各组肝组织中IL-6、IL-1β 和TNF-α 水平比较 （n=12，pg/ml，±s）

注：①与对照组比较，P＜0.05，②与模型组比较，P＜0.05。

组别 IL-6 IL-1β TNF-α对照组 61.18±6.62 20.92±1.40 156.45±5.45模型组 336.61±14.29① 58.90±6.35① 632.16±14.57①低剂量组 330.68±4.14 55.49±3.79 623.37±10.02中剂量组 221.77±9.45② 41.92±4.00② 377.85±15.33②高剂量组 138.44±4.37② 32.26±4.13② 288.44±6.72②F 值 192.515 32.394 168.302 P 值 0.000 0.000 0.000

2.5 决明子总蒽醌对ALI 大鼠肝组织中HMGB1、TLR4 及NF-κB 蛋白表达的影响

各组肝组织中HMGB1、TLR4 及NF-κB 蛋白相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；模型组较对照组升高（P＜0.05），中、高剂量组较模型组下降（P＜0.05）。决明子总蒽醌对ALI 大鼠肝脏HMGB1、TLR4 及NF-κB 蛋白的调控作用具有剂量依赖性。见表3 和图3。

表3 各组肝组织中HMGB1、TLR4 及NF-κB 蛋白相对表达量比较 （n=12，±s）

表3 各组肝组织中HMGB1、TLR4 及NF-κB 蛋白相对表达量比较 （n=12，±s）

注：①与对照组相比，P＜0.05，②与模型组相比，P＜0.05。

组别 HMGB1 TLR4 NF-κB对照组 0.96±0.08 0.97±0.07 0.98±0.07模型组 3.90±0.28① 4.60±0.13① 2.66±0.24①低剂量组 3.79±0.21 4.50±0.18 2.54±0.19中剂量组 2.89±0.33② 2.88±0.29② 1.98±0.23②高剂量组 2.32±0.18② 2.36±0.18② 1.58±0.10②F 值 20.482 23.434 13.523 P 值 0.002 0.000 0.003

图3 肝组织中HMGB1、TLR4 及NF-κB 蛋白的表达

3 讨论

ALI 可由多种因素引起，是以肝功能迅速恶化为临床特点的急性综合征，影响肝脏的解毒、生物转化和排泄等功能，严重者会出现肝脏大面积坏死直至衰竭[10]。ALI 病死率较高，给患者家庭及社会造成沉重负担，如何治疗ALI 仍是临床医学中具有挑战的课题之一。因此研究ALI 的发病机制，探索新的治疗药物和方法具有重要的临床价值。

现代药理学研究表明，决明子具有良好的抗炎、抗纤维化、降血压、抗氧化等多种生物学功能[11]。有研究发现，决明子总蒽醌能明显降低免疫性肝损伤大鼠肝组织炎症因子的表达水平[12]。MENG 等[13]研究证实，决明子总蒽醌能影响血清中CTGF 和TGF-β1的含量，改善慢性肝衰竭大鼠的肝功能。有报道称，决明子总蒽醌能明显抑制病毒感染大鼠的肝组织纤维化[14]。有学者通过构建四氯化碳诱导的肝纤维化大鼠模型发现，大鼠经决明子总蒽醌治疗后肝脏组织中凋亡蛋白水平降低，免疫系统被激活，炎症细胞浸润明显好转[15]。以上结果提示决明子总蒽醌对多种原因引起的肝细胞凋亡能起到保护作用。然而决明子总蒽醌在LPS 诱导ALI 中的研究目前少有报道。本研究发现，与对照组相比，模型组大鼠肝功能明显降低，肝脏细胞肿胀变形，并可见较多炎症细胞浸润，肝脏组织细胞凋亡数目明显增多。经过决明子总蒽醌处理后，与模型组相比，肝脏病理改变明显，肝细胞凋亡受到明显抑制，呈剂量依赖性。

有研究发现，ALI 伴有大量的炎症细胞浸润，肝上皮细胞通透性在逐级放大的炎症反应中增强，最终引起肝组织纤维化和肝水肿[16]。IL-1β、IL-6 和TNF-α 作为反映炎症水平的重要因子，在诱导肝衰竭过程中发挥重要作用[17]。本研究结果显示，经决明子总蒽醌治疗后的ALI 大鼠肝组织中IL-1β、IL-6和TNF-α 水平明显降低。说明决明子总蒽醌可以有效降低LPS 诱导ALI 大鼠肝脏的炎症水平。HMGB1、TLR4 及NF-κB 是与炎症相关的重要信号通路，有学者研究发现外周血中HMGB1 水平升高，会伴有炎症症状加重，HMGB1 与炎症介质相互作用构成免疫刺激复合物是促进这一过程的重要机制[18]。另有文献报道HMGB1 可通过TLR4 信号通路调控非酒精性肝损伤大鼠炎症反应，TLR4 在HMGB1 调控下，其下游磷酸化水平升高，进而活化NF-κB，而NF-κB 蛋白与细胞炎症反应及其凋亡作用密切相关[19]。本研究结果显示，模型组大鼠HMGB1、TLR4 及NF-κB 蛋白相对表达量明显升高，中、高剂量组大鼠HMGB1、TLR4、NF-κB 蛋白相对表达量降低，提示决明子总蒽醌可能通过HMGBA 介导TLR4、NF-κB 通路，对LPS 诱导的ALI 发挥保护作用。

综上所述，决明子总蒽醌可以抑制LPS 诱导ALI模型大鼠的HMGB1/TLR4/NF-κB 信号通路的激活，从而减轻对脏器的损害，改善肝功能。但决明子总蒽醌是否还能通过调节其他信号通路发挥作用，以及如何将决明子总蒽醌应用于ALI 患者的临床治疗，仍需进一步研究。