接智慧，周岩，高翔，邵婷，张雪英

（1.山东第一医科大学第二附属医院 妇产科，山东 泰安 271000；2.赤峰学院附属医院妇产科，内蒙古 赤峰 024000）

子宫内膜癌发病率仅次于宫颈癌，且有逐年上升的趋势[1]。根据2014年我国肿瘤登记年报，子宫内膜癌的发病率在女性恶性肿瘤中居第9 位，且患病人群呈年轻化趋势[2]，给患者和社会带来沉重的负担。虽然手术结合放疗、化疗及激素治疗等方法使子宫内膜癌疗效提高，但晚期患者疗效仍较差[3]。因此，探讨子宫内膜癌发生、发展的分子生物学机制，寻找治疗新靶点成为研究热点。近年来研究发现，线粒体融合蛋白2（Mitofusin 2,MFN2）在多种恶性肿瘤中存在差异表达，且与肿瘤患者的不良预后有关[4]。但MFN2 在子宫内膜癌中的表达及与预后的关系国内外报道较少，本研究采用免疫组织化学SP 法和qRTPCR 检测MFN2 在子宫内膜癌组织、非典型增生组织和正常子宫内膜组织中的表达，分析MFN2 蛋白与子宫内膜癌临床病理特征及预后的关系，为进一步探究MFN2 在子宫内膜癌发生、发展过程中的作用提供研究基础，同时为子宫内膜癌的诊断和治疗提供新策略。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2010年1月—2014年1月在山东第一医科大学第二附属医院经病理诊断为子宫内膜腺癌后行手术治疗的72 例患者标本作为子宫内膜癌组。其中，年龄30 ～71 岁，平均50.5 岁；病理类型：I型60 例，Ⅱ型12 例。依照2009年国际妇产科联盟（Federation International of Gynaecology and Obstetrics,FIGO）分期标准，I、Ⅱ期41 例，Ⅲ、Ⅳ期31 例；分化程度：低分化21 例，中分化40 例，高分化11 例。另收集同期本院33 例子宫内膜非典型增生患者的内膜组织标本作为非典型增生组。其中，年龄32 ～68 岁，平均51.4 岁。收集同期本院20 例因宫颈上皮内瘤变Ⅲ级行全子宫切除术的正常子宫内膜组织标本作为正常子宫内膜组（包括增生期内膜组织11 例，分泌期内膜组织9 例）。其中，年龄38 ～50 岁，平均45.4 岁。此外，收集20 例正常子宫内膜、23 例非典型增生和40 例子宫内膜癌的新鲜组织，均在大体标本离体后30 min 内采集，立即放入液氮，然后转入-80℃保存，行qRT-PCR 检测。子宫内膜癌患者术前均未行放疗、化疗及介入等抗肿瘤治疗，纳入患者（子宫内膜癌、非典型增生、正常子宫内膜）术前均未行内分泌治疗。本研究通过医院伦理委员会批准，患者及其家属知情同意。

1.2 方法

1.2.1 试剂与仪器鼠抗人MFN2 抗体购自美国Abcam 公司（货号ab56889），免疫组织化学SP 试剂盒和DAB 显色试剂盒购自福州迈新公司（货号KIT-9730），苏木精染色剂购自珠海贝索生物公司，Trizol 购自美国Invitrogen 公司，cDNA 逆转录试剂盒购自美国 Thermo Scientific 公司（货号K1622），qRTPCR 检验试剂盒购自珠海莫纳生物科技公司（货号MQ00201），目的基因及内参基因引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。7500 型定量PCR 扩增仪（美国ABI 公司）。

1.2.2 免疫组织化学SP 法对正常子宫内膜、内膜非典型增生和子宫内膜癌组织中MFN2 的表达进行检测。石蜡包埋组织后进行连续性切片，脱蜡至水后采用过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性，室温孵育10 min，PBS 冲洗3 次后蛋白粉封闭2 h，将兔抗人MFN2 抗体（1∶1 000）加入后，4℃过夜，复温后滴加二抗（1∶400），室温孵育30 min，加入辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标志物，室温孵育10 min。PBS 冲洗后滴加DAB 显色，复染、脱水、封片。镜检并拍照记录。结果判定：MFN2 蛋白阳性表现为细胞质出现棕黄色颗粒。染色强度：无着色为0 分，浅黄色为1 分，棕黄色为2 分，棕褐色为3 分。阳性细胞比例：＜26%为1 分，26%～50%为2 分，＞50%为3 分。根据染色强度和阳性细胞比例乘积判定：得分≥5 分为高表达，＜5 分为低表达[5]。结果由2 名观察者独立阅片判定。

1.2.3 qRT-PCR采取Trizol 一步法提取组织中总RNA，紫外分光光度计测定RNA 浓度及纯度（OD 260/OD 280比值1.8 ～2.0），按逆转录试剂盒说明书将RNA 逆转录成cDNA，置于-20℃冷冻保存备用。MFN2 正向引物：5'-AACCCGGTCAT CTAACCCGT-3'，长度20 bp；反向引物：5'-TACTCCA CTATCGTTCTCTATTGAG-3'，长度25 bp。GAPDH 正向引物：5'-ACGCCTGCGCACTCGCATG-3'，长度19 bp；反向引物：5'-TAGTCGGACTGAGTTACTGC-3'，长度20 bp。qRT-PCR 扩增体系为20μl，反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性10 s，63℃退火20 s，72℃延伸20 s，共计40 个循环。每一样本重复3 次。采用2-∆∆Ct法对MFN2 mRNA 相对表达量进行定量分析。

1.3 随访

采用电话或者门诊随访。随访时间为患者术后1 ～73 个月，中位随访时间42 个月，随访终点事件为患者死亡或者到达随访截止时间（2019年4月）。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 24.0 及GraphPrism 8.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析；计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验，进一步两两比较用校正检验水准法（α=0.0125）；Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，比较用Log-rank χ2检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组MFN2 蛋白表达比较

MFN2 蛋白阳性表现为细胞质出现棕黄色颗粒（见图1），在正常子宫内膜组、非典型增生组和子宫内膜癌组高表达率分别为85.0%、39.4%及20.8%（见图2），经χ2检验，差异有统计学意义（P＜0.05），子宫内膜癌组低于非典型增生组和正常子宫内膜组（P＜0.05）。见表1。

图1 3 组MFN2 蛋白表达情况 （SP 法×200）

图2 3 组MFN2 蛋白免疫组织化学评分比较

表1 3 组MFN2 蛋白表达水平比较 例（%）

2.2 不同临床病理特征子宫内膜癌患者的MFN2蛋白表达

子宫内膜癌组不同年龄、是否绝经及不同肌层浸润深度的MFN2 蛋白高表达率比较，差异无统计学意义（P＜0.05）；而不同病理类型、不同分化程度、有无淋巴结转移及不同FIGO 分期的MFN2 蛋白高表达率比较，差异有统计学意义（P＜0.05），病理类型Ⅱ型高于I型，低分化高于高分化，无淋巴结转移高于有淋巴结转移，FIGO 分期I、Ⅱ期高于Ⅲ、Ⅳ期。见表2。

2.3 MFN2 蛋白表达与子宫内膜癌患者预后的关系

72 例子宫内膜癌患者中，MFN2 高表达者57 例，低表达者15 例。经过5年随访，无患者失访。Kaplan-Meier 法绘制的生存曲线结果显示，高表达者的中位生存期为47 个月，低表达者的中位生存期为26 个月。MFN2 高表达组3年生存率为73.3%，5年生存率为33.3%；MFN2 低表达组3年生存率为38.6%，5年生存率为9.8%。两组生存率比较，经Log-rank χ2检验，差异有统计学意义（χ2=7.077，P=0.008）。见图3。

表2 不同临床病理特征子宫内膜癌患者的MFN2 蛋白表达 例

图3 子宫内膜癌患者生存曲线

2.4 3 组MFN2 mRNA 相对表达量比较

qRT-PCR 检测结果显示，MFN2 mRNA 在正常子宫内膜组、非典型增生组及子宫内膜癌组相对表达量分别为（2.200±0.234）、（1.063±0.158）及（0.622±0.119），经方差分析，差异有统计学意义（F=115.462，P=0.000），子宫内膜癌组较正常子宫内膜组、非典型增生组低（P＜0.05）。见图4。

图4 3 组MFN2 mRNA 相对表达量比较 （±s）

3 讨论

子宫内膜癌是女性生殖系统常见恶性肿瘤之一，近30年来，其发病率逐年增加，且复发率和病死率较高[6]。尽管通过手术联合放疗、化疗等综合治疗提高早期患者生存率，但是对晚期患者的治疗难度仍较大，且病死率仍高居不下[7]。目前研究认为，子宫内膜癌是一种高度异质性的肿瘤，且多种危险因素可诱发子宫内膜癌，如高血压、绝经状态、不孕症及家族史等[8]。关于其机制研究较多，但尚未有统一定论。因此，深入研究、阐明子宫内膜癌发病机制，寻找新的防治方法是目前子宫内膜癌研究的紧迫任务。

MFN2 由定位于chr 1p 36.22 的MFN2基因编码，含757 个氨基酸残基，锚定于线粒体外膜的U 型跨膜蛋白[9]。目前研究表明，MFN2 在维持线粒体正常形态、调节线粒体的新陈代谢及参与细胞信号传导等生理功能方面有重要作用[10]。有学者研究指出，MFN2低表达与线粒体过度分裂有关，在癌细胞增殖、凋亡、代谢紊乱、细胞运动和迁移过程中起重要作用，并且可以激活固有的（线粒体）凋亡通路，而MFN2 高表达可通过抑制线粒体分裂调控细胞存活、耐药[11]。MFN2 表现出多方面的作用，目前许多学者认为，MFN2 在肿瘤细胞的增殖、凋亡细胞自噬中有重要作用[12]。多位学者分别在膀胱癌[13]、肝癌[14]、肺癌[15]等肿瘤组织中证实，MFN2 在肿瘤中呈低表达，可能发挥抑癌基因作用，但在子宫内膜癌中的研究较少。

本研究结果显示，MFN2 在子宫内膜癌组织中的表达均低于非典型增生及正常子宫内膜组织。MUSICCO 等[16]研究认为，I型子宫内膜癌组织中MFN2 蛋白表达低于正常内膜组织及内膜增生组织，在有线粒体突变的癌组织中降低更为显著，这与本研究结果一致。进一步分析子宫内膜癌患者的临床病理特征，结果表明MFN2 蛋白低表达与子宫内膜癌患者的病理类型、分化程度、FIGO 分期及有无淋巴结转移有关；而与患者年龄、是否绝经及肌层浸润深度无关，提示MFN2 蛋白低表达与子宫内膜癌的发生、发展有重要关系。MITSUDOMI 等[17]研究发现，MFN2基因在人乳腺癌MCF-7 细胞系中表达降低，而过表达MFN2 后可抑制MCF-7 细胞增殖。徐斌武等[18]研究证实，MFN2 蛋白在骨肉瘤细胞中表达降低可促进肿瘤细胞增殖、侵袭和肿瘤细胞干性特征，这些研究均提示MFN2基因在肿瘤的发生、发展过程中起抑癌基因的作用，其低表达将促进肿瘤的进展。因此认为，MFN2 蛋白在子宫内膜癌中低表达，可能发挥抑癌基因作用，低表达可能促进子宫内膜癌肿瘤细胞的增殖、侵袭。

Kaplan-Meier 法生存曲线结果显示，本研究中MFN2 低表达子宫内膜癌患者的中位生存期为23.5 个月，高表达患者的中位生存期为32.5 个月，MFN2 低表达患者的中位生存期低于高表达患者。SOARES等[19]应用免疫组织化学方法检测头颈部黏膜黑色素瘤组织中MFN2 蛋白表达，发现MFN2 蛋白在肿瘤组织中低表达，且与较低的无病生存期和总生存期有关。本研究结果与SOARES 等[19]的结果一致。因此，在今后的临床治疗中可通过检测MFN2 蛋白在子宫内膜癌组织中的表达来作为对患者预后的重要参考指标。

综上所述，MFN2 的表达与子宫内膜癌的病理类型、FIGO 分期、分化程度及淋巴结转移有关，提示两者可能与子宫内膜癌的发生、发展密切相关。因此，检测两者的相关性可对疾病的预后有提示作用，为子宫内膜癌的诊治提供新的思路和线索。