徐伟，王健，丁卓峰，李珍，张洁

（1.湖南省妇幼保健院 麻醉科，湖南 长沙 410008；2.中南大学湘雅医院 麻醉科，湖南 长沙 410008）

癌痛是恶性肿瘤患者最常见的症状之一。许多的恶性肿瘤，如前列腺癌、乳腺癌、肺癌常伴有骨转移，导致严重的骨破坏和癌性疼痛，严重影响患者的生活质量[1-3]。吗啡是目前临床上用来治疗中重度癌痛的常用药物[4]。但长期使用吗啡会带来许多不良反应，如便秘、搔痒及吗啡耐受等[5]。其中，吗啡耐受是影响临床上吗啡使用最主要的不良反应，目前其具体机制仍不明确[6-7]。甘氨酸转运体2（glycine transporter 2,GlyT2）是调控突触间甘氨酸浓度的重要转运体。既往研究发现，鞘内注射GlyT2 抑制剂或敲除GlyT2 可以减轻骨癌痛，并增强单次注射吗啡的镇痛效能[8]。但目前尚未有研究探寻抑制GlyT2 表达对大鼠骨癌痛吗啡耐受的影响。本研究拟复制骨癌痛模型，使用慢病毒载体部分敲除GlyT2 表达，明确其对骨癌痛大鼠吗啡耐受形成的影响。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

Walker 256 乳腺癌细胞购自北京鼎国昌盛生物公司。von Frey 纤维丝（美国Northcoast 公司），7370 型热痛仪（意大利UGO 公司）。兔抗GlyT2 抗体（美国Abcam 公司），山羊抗兔辣根过氧化物酶标记IgG二抗（美国Jackson 公司），GlyT2 siRNA 慢病毒载体（LV-GlyT2 siRNA）（上海吉凯基因化学技术有限公司）。

1.2 动物模型的复制与分组

清洁级成年雌性SD 大鼠，体重180 ～220 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，饲养于中南大学实验动物学部，实验动物生产许可证号：SCXK（湘）2019-0004。采用改良Yaksh 法进行鞘内置管[9]，将鞘内置管成功的30 只大鼠随机分为鞘内注射生理盐水组（NS 组）、鞘内注射阴性对照病毒组（LVNC 组）及鞘内注射GlyT2 siRNA 病毒组（LV-GlyT2 siRNA 组），每组10 只。参照MAO-YING 等[10]的方法复制骨癌痛模型，在大鼠左侧后肢胫骨上段骨髓腔注入Walker 256 乳腺癌细胞10μl（4×105个/ml）。NS 组、LV-NC 组、LV-GlyT2 siRNA 组大鼠接种后第7 天分别鞘内注射生理盐水10μl，阴性对照病毒10μl（滴度1×109TU/ml），GlyT2 siRNA阳性病毒载体10μl（滴度1×109TU/ml）。接种后第9 天开始3 组大鼠均鞘内注射吗啡（湖北宜昌人福药业，批号：H21022436），10μg/次，2 次/d，连续7 d。

1.3 疼痛相关行为学检测

1.3.1 机械缩足阈值（mechanical withdrawal threshold,MWT）3 组大鼠分别在癌细胞接种前及接种后7 d 测定术侧后肢MWT[11]。将von Frey 纤维丝垂直伸向大鼠后肢足底，当大鼠出现抬足或舔足时，记录von Frey 克数，每次间隔10 min。每组大鼠测定3 次，取最小值。

1.3.2 最大可能效能百分比（percent of the maximum possible effect,%MPE）3 组大鼠在吗啡注射前，以及注射后1 d、3 d、5 d、7 d 测量大鼠热痛阈甩尾潜伏期，并计算%MPE[12]。将大鼠尾部置于刺激仪辐射源正中，刺激仪辐射强度设为54℃，临界值设为20 s，当尾部甩动时记录时间。测量3 次取平均值，每次间隔10 min。以%MPE 表示吗啡的镇痛效能，%MPE=（效应时间-基础时间）/（临界值-基础时间）×100%。

1.4 Western blotting 检测大鼠脊髓GlyT2 蛋白的表达

取大鼠脊髓腰膨大，加入预冷的RIPA 裂解液，离心后取上清液，利用BCA 法测量蛋白浓度，随后将各组50μg 蛋白样品上样，在10% SDS-PAGE 凝胶中，80 V 恒压电泳30 min，然后120 V 电泳60 min。随后恒流280 mA，60 min 转膜。转膜成功后，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入兔抗GlyT2 多克隆抗体（1∶400），兔抗Tublin 抗体（1∶2 000）4℃孵育过夜，第2 天用1% TBST 室温洗膜后加入生物素标记的山羊抗兔二抗（1∶5 000），室温孵育1 h，清洗后用ECL 发光液进行显色。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0 统计软件。计量数据采用均数±标准差（±s）表示，比较用单因素方差分析或重复测量设计的方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 行为学结果

3 组大鼠在癌细胞接种前及接种后7 d 的术侧后肢MWT 比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间的大鼠MWT 有差异（F=526.900，P=0.000）；各组大鼠癌细胞接种后术侧MWT 均较接种前下降（P＜0.05），说明骨癌痛模型复制成功。②3 组大鼠MWT 无差异（F=0.077，P=0.926）。③3 组大鼠MWT 变化趋势无差异（F=1.796，P=0.185）。见表1。

3 组大鼠注射吗啡后1 d、3 d、5 d、7 d 的%MPE比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点大鼠%MPE 有差异（F=575.280，P=0.000）。②3 组大鼠%MPE 有差异（F=19.461，P=0.000）。注射吗啡后5 d 和7 d，LV-GlyT2 siRNA 组%MPE 高于其他两组（P＜0.05），说明鞘内注射LV-GlyT2 siRNA可以缓解骨癌痛大鼠吗啡耐受。③3 组大鼠%MPE变化趋势有差异（F=15.25，P=0.000）。见表2 和图1。

表1 3 组大鼠癌细胞接种前后术侧后肢MWT 比较 （n=10，g，±s）

表1 3 组大鼠癌细胞接种前后术侧后肢MWT 比较 （n=10，g，±s）

组别 接种前 接种后7 d NS 组 8.80±1.39 2.42±1.46 LV-NC 组 8.40±1.26 3.20±1.39 LV-GlyT2 siRNA 组 8.80±1.03 2.60±1.27

表2 3 组大鼠不同时间点%MPE 比较 （n=10，%，±s）

表2 3 组大鼠不同时间点%MPE 比较 （n=10，%，±s）

组别 1 d 3 d 5 d 7 d NS 组 94.32±8.58 58.09±11.34 27.29±12.24 18.20±9.46 LV-NC 组 94.59±7.93 60.20±10.72 32.09±8.65 19.86±12.76 LV-GlyT2 siRNA 组 96.09±5.71 70.61±11.07 55.20±8.35 52.34±7.25

图1 3 组大鼠%MPE 的变化趋势 （n=10，±s）

2.2 3 组大鼠GlyT2 蛋白相对表达量比较

吗啡注射第7 天，3 组大鼠GlyT2 蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（F=53.880，P=0.000）；LV-GlyT2 siRNA 组低于LV-NC 组和NS组（P＜0.05）。见图2。

图2 3 组大鼠吗啡注射后7 d 脊髓腰膨大GlyT2 蛋白的表达

3 讨论

本研究结果表明，骨癌痛大鼠鞘内注射LVGlyT2 siRNA 后脊髓GlyT2 表达下调，在给予吗啡处理后的第5 天和第7 天，大鼠%MPE 较LV-NC 组及NS 组明显升高，说明鞘内注射GlyT2 siRNA 慢病毒载体能够延缓骨癌痛大鼠吗啡耐受的形成。

GlyT2 是调节突触间甘氨酸浓度的重要转运体，其可以将突触间隙中的甘氨酸重新摄入突触前囊泡，清除突触间隙中的甘氨酸[13-14]。甘氨酸是中枢神经系统重要的抑制性神经递质，在突触可塑性形成及疼痛信号传导中发挥重要作用[15-17]。甘氨酸在神经系统中的作用分为2 种：一种是与体内甘氨酸受体结合，抑制神经冲动传导；另一种是与NMDA 兴奋性受体上的甘氨酸-B 位点作用，协同激活NMDA 受体，参与兴奋性神经传递[18-19]。研究发现，GlyT2 选择性抑制剂如Org25543、ALX1393 及GT-0198 可以减轻神经病理性疼痛[20-22]。最近有研究发现，鞘内注射GlyT2 抑制剂或GlyT2 siRNA 可以缓解骨癌痛相关的痛觉异常及痛觉过敏，并且可以增强单次给予吗啡的镇痛效能[8]。本实验中骨癌痛大鼠鞘内注射GlyT2 siRNA 慢病毒载体后GlyT2 表达下调，使用吗啡处理后，大鼠%MPE值仍维持在50%以上，说明抑制GlyT2 表达能延缓吗啡耐受的形成。GlyT2 抑制剂有时难以透过血-脑屏障，且靶组织的渗透作用较弱，因此选择操作简便、效果可靠的给药方式保证GlyT2 表达下调或功能抑制是研究及临床运用的关键。慢病毒载体介导的LVGlyT2 siRNA 可以相对局限地作用于注射部位，能够转染多种神经细胞，不良反应少，并且单次注射后可以长期且稳定地发挥生物学效应[23-24]。由于慢病毒载体注射入大鼠体内后一般4 d 或5 d 开始产生作用，并在1 周左右达最大效应，因此本研究选择在接种癌细胞后第7 天通过鞘内注射GlyT2 siRNA 慢病毒载体，以期在吗啡发挥作用期间产生最佳效应。

LV-GlyT2 siRNA 缓解吗啡耐受的具体机制不明确，可能与增强甘氨酸能神经冲动有关。研究发现，给予GlyT2 抑制剂可以延长脊髓X 板层神经元中甘氨酸能IPSPs 的衰减时间[25]，提示GlyT2 抑制剂可以在感觉神经元中促进甘氨酸能神经传递，其认为抑制胶质细胞或神经元中甘氨酸转运体可以提高脊髓中甘氨酸浓度，并延长甘氨酸能电位的持续时间。WHITEHEAD 等[26]通过微透析的方法发现，给予大鼠GlyT2 选择性抑制剂可以提高大鼠脊髓脑脊液中的甘氨酸浓度。笔者将在后续实验中测量脊髓脑脊液中的甘氨酸浓度，以明确LV-GlyT2 siRNA 缓解吗啡耐受的具体机制。

综上所述，大鼠鞘内注射GlyT2 siRNA 慢病毒载体可延缓骨癌痛大鼠吗啡耐受的形成。