李莎 洪艳 韩笑 赵龙山 王洋

【摘 要】：目的：分离并筛选汉桃叶镇痛的药效的物质基础，为汉桃叶和以汉桃叶为主药材的制剂的质量控制方法建立和技术改造升级提供依据。方法：采用不同溶剂对汉桃叶进行提取，后采用大孔吸附树脂法对汉桃叶提取物进行分离，获得A组分（水洗脱部位）、B组分（10%-30%乙醇洗脱部位）、C组分（50%-75%乙醇洗脱部位）和D组分（有机酸部位）。通过热板实验对汉桃叶总提物和四个分离部位的活性进行测试，筛选药效部位。结果：A、B、C组分均表现出了镇痛活性，其中A组分的镇痛活性较其他两组更稳定，而C组分活性较B组分更强。通过进一步的成分分析，得出A组分多为单糖和多糖类物质，B组分含有大量黄酮和皂苷类物质，C组分含有大量的皂苷类物质。结论：汉桃叶中镇痛活性与汉桃叶单糖和多糖关系更密切，与皂苷类物质含量也有一定相关性。

【关键词】汉桃叶;镇痛;药效物质基础

【中图分类号】R282.5【文献标识码】A【文章编号】1672-3783（2020）07-21--01

汉桃叶为五加科植物白花鹅掌柴（ScheffierakwangsiensisMerr.exLi）的根或茎、叶，又名广西鹅掌柴，产于贵州[1]。汉桃叶具有祛风止痛，舒筋活络之功效。用于治疗三叉神经痛，坐骨神经痛、风湿关节痛[2]，目前被做成多种中药制剂上市，如汉桃叶胶囊，汉桃叶片等，应用较广[2]。目前汉桃叶化学成分中有机酸类成分被认是药效作用成分[3-5]。为进一步研究汉桃叶镇痛活性的药效物质基础，本论文利用层析技术对汉桃叶进行分离得到不同极性部位，并采用薄层色谱法和紫外分光光度法对汉桃叶不同部位的化学成分进行分析，最终确定汉桃叶镇痛活性的药效活性成分。

1 仪器与试药

1.1 仪器

AL-104电子分析天平（德国梅特勒公司）;KQ-300DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）;紫外分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）。

1.2 试药

齐墩果酸（99.4%），芦丁（99.4%）由深圳卓越生物科技有限公司提供;吲哚美辛由大连美罗药业提供;香草醛（99%）购自天津大茂化学有限公司。生理盐水和乙醇购自沈阳禹王有限公司。HP20大孔树脂（批号7G504）购自日本日立公司，101*7阴离子交换树脂，201*7阳离子交换树脂购自宁波争光树脂厂。薄层层析板购自青岛海洋化工厂。

1.3 动物

SPF级KM种小鼠，18-22g，雌性由沈阳药科大学试验动物中心提供，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。

2 方法和结果

2.1 汉桃叶不同部位的富集

取汉桃叶药材1kg，用70%乙醇提取两次，过滤，回收醇提液，药渣干燥，后按照药典中水提醇沉方法再次提取药渣，得到水提液。将醇提液与水提液合并，浓缩干燥得到浸膏粉末100g。取汉桃叶浸膏粉末65g，将其完全溶解于300ml的去离子水中，上样至Hp20大孔吸附树脂，依次用3倍柱体积的水、10%、20%、30%、50%、75%和95%乙醇依次洗脱，50℃减压浓缩至干浸膏，后冻干至干燥粉末，得到水洗脱部位（20.8g，32%），10%乙醇洗脱部位（3.2g，4.9%），20%乙醇洗脱部位（5.5g，8.4%），30%乙醇洗脱部位（4.2g，6.4%），50%乙醇洗脱部位（10.3g，15.8%），75%乙醇洗脱部位（2.3g，3.5%），95%乙醇洗脱部位（0.67，1.0%）。通過薄层分析，将成分相似的部位合并，得到A组分（水洗脱部位，32%）、B组分（10%，20%，30%乙醇洗脱部位，19.9%）、C组分（50%，70%乙醇洗脱部位，19.3%）。

取汉桃叶浸膏粉35g溶解于200ml去离子水中，将浸膏溶液上样于201*7阴离子交换树脂上，收集1%HCl的洗脱液，后减压蒸馏浓缩，得到初步有机酸富集部位浸膏液[3]。后取001*7阳离子交换树脂800ml，将其进行溶胀、活化。将富集到的有机酸浸膏液100ml上样，用4倍柱体积去离子水进行洗脱，回收洗脱液，减压浓缩至浓浸膏，后置于冻干机上去除水分，得到D组分有机酸类富集组分（7.2g，20%）。

2.2 汉桃叶的镇痛的药效学实验

2.2.1 给药剂量确定

设定小鼠灌胃给药体积为10mL/kg，在已有论文和前期预实验的基础上，设定汉桃叶总提物的实验剂量为5g/kg/d。为提高药效实验的结果的显著性，四个组分的给药剂量之和是在总提物的1.8倍的实验剂量（9g/kg/d）的基础上，按照此部位占总提物的含量百分比进行换算得到的。这种换算方式在考察不同部位各自的药效活性的同时，同时考虑了不同化合物的在总提物中的质量占比，与用药实际情况更加符合。最终几个部位给药量分别为2.8g/kg/d（A组分），1.8g/kg/d（B组分），1.7g/kg/d（C组分），2.8g/kg/d（D组分）。

2.2.2 实验方法

将雌性小鼠投入至热板致痛仪中，将热板致痛仪温度控制在（55±0.5）℃，至出现舔后足的时间（s）作为该鼠的痛阈值，小于5s或大于30s或跳跃者弃之不用。筛选合格雌性小鼠，重复测其正常痛阈值，取两次正常痛阈的平均值作为该鼠给药前痛阈值。随机分组，每组12只。

阴性对照组小鼠给生理盐水，阳性对照组给吲哚美辛20mg/kg/d，汉桃叶A、B、C、D组每组每天按照小鼠体重以剂量0.1mL/10g灌胃给药1次，连续7d。

测定小鼠给药后第30、60、90、120min的痛阈值。如果痛阈超过60s，按60s记录，并计算痛阈提高率。痛阈提高率（%）=（给药后痛阈值-给药前痛阈值）/给药前痛阈值×100。

2.2.3 实验结果

汉桃叶总体物在热板镇痛试验中，四个时间点30min、60min、90min、120min与给药前相比，均表现出镇痛活性，痛阈值提高百分比分别为30%、82%、80%、50%（表1），效果弱于阳性药吲哚美辛组。

在四个组分的热板镇痛试验中，除D组未表现出镇痛活性，其余三组均有镇痛活性。其中，B组只在90min时表现出镇痛活性，痛阈提高百分比为77.84%;C组镇痛活性优于B组，在90min和120min均表现出镇痛活性，痛阈提高百分比为116.23%和84.93%，且优于该时间点的阳性药组吲哚美辛90min（88.27%）和120min（58.93%）。A组在四个时间点30min、60min、90min、120min与给药前相比，均表现出镇痛活性，痛阈值提高百分比分别为32.95%、46.82%、47.98%、60.12%，抗炎镇痛活性弱于阳性药组，但在30min和60min时间点优于C组。

2.3 药效部位成分分析

2.3.1 薄层鉴别实验

2.3.1.1 黄酮类成分薄层鉴别

将水、10%、20%、30%，50%、75%和95%洗脱部位和有机酸部位用各自的洗脱溶剂溶解，总浸膏粉末和有机酸部位分别用20%甲醇和水溶解，依次于薄层板上点样。以二氯甲烷-甲醇-冰醋酸（8：5：0.5）为展开剂，三氯化铝-乙醇溶液为显色剂，在紫外波长365nm下进行观察对汉桃叶提取物各部位进行分析，结果如图1所示。

此反为鉴别黄酮类成分的常用方法，通过喷洒三氯化铝显色剂，黄酮类成分与三氯化铝进行络合，呈现黄色或蓝色条带。结果如图1所示，在总提取物、10%，20%，30%，50%，75%乙醇洗脱部位均出现明显的荧光条带，说明总提取物，药效试验B和C组分中中含有黄酮类成分。

2.3.1.2 皂苷类成分薄层鉴别

将水、10%、20%、30%，50%、75%和95%洗脱部位和有机酸部位用各自的洗脱溶剂溶解，总浸膏粉末和有机酸部位分别用20%甲醇和水溶解，依次于薄层板上点样。以二氯甲烷-甲醇-冰醋酸（8：5：0.5）为展开剂，醋酐-浓硫酸溶液为显色剂，对汉桃叶提取物各部位进行分析，结果如图2所示。

醋酐-浓硫酸溶液为三萜和甾体皂苷的显色剂，三萜皂苷会在显色剂的作用下呈现红、蓝、紫等颜色的显色但不出现绿色，甾体皂苷会经过一系列的颜色变化，最终显绿色。如薄层色谱图2可见，经过树脂的分段，不同极性的化合物被成功分离到不同的富集部位。总浸膏、10%，20%，30%，50%，75%乙醇洗脱部位分别出现了紫色的显色反应条带，可知药效试验中总提取物，B组分和C组分均含有大量的皂苷。通过颜色可判断皂苷类型主要为三萜皂苷。同时，根据显色反应的条带深浅程度，可判断C组分含有皂苷含量较多。

2.3.2 汉桃叶总浸膏和各富集部位的总黄酮和总皂苷含量测定

在2015版藥典中，汉桃叶片是应用紫外光度法，以芦丁为对照品测总黄酮的含量来进行质量控制，因此本实验应用药典中的总黄酮的测定方法对富集到的各个部位的总黄酮含量进行测定。通过已有的文献报道和以上的薄层鉴别实验我们知道汉桃叶含有大量的三萜皂苷类成分。有报道此类成分具有较好的镇痛的药效[8-10]，因此我们以齐墩果酸为对照品，测各部位中总皂苷类成分的含量。用以上两实验结果区别这两类成分在各部位中的含量差异。

按中国药典中黄酮总量的检测方法进行操作，得到建立标准曲线为y=12.766x+0.0071。后取各样品约0.16g对各部位中进行测试，结果见表1。按相关文献中的方法绘制齐墩果酸的标准曲线，后对样品进行测定。将样品各称取10mg溶解于5ml的甲醇中，得到5ml样品液。按上述齐墩果酸标准曲线制备流程，对样品液进行测定，将得到的数值代入线性回归方程，计算出样品中总皂苷含量，结果见表2。

由表1所示，在富集到各部位中，10%，20%，30%的乙醇洗脱部位（B组分）中含有黄酮量和皂苷含量最多。而水洗脱部位中黄酮含量约为4%，皂苷含量较少，推测多为单糖和多糖类物质。在B组分（50%，75%乙醇洗脱部位）中，皂苷和黄酮含量均小于4%。有机酸部位紫光吸光度示数过低，说明皂苷和黄酮含量极低。

3 结果与讨论

结合以上化学组分分析和药效活性实验，可知在汉桃叶的镇痛药效活性中，A、B、C三个组分均表现出了镇痛活性，其中A组分的镇痛活性较其他两组更稳定，而C组分活性优于B组分。这几个部位中，A组分含有多为单糖和多糖类物质，B组分含有大量黄酮和皂苷类物质，C组分含有皂苷类物质。因此我们推断，汉桃叶中镇痛活性应该与汉桃叶单糖和多糖关系更密切，与皂苷类和黄酮类物质含量也有一定相关。因此在后续得质量控制中，可以加强这几类特别是糖类物质的监测。

参考文献

[1] 上海中药一厂技术组， 汉桃叶有效成分的研究， 中成药研究， 1978， 3， 6-11.

[2] 中国药典（ 2015年版一部）〔M〕. 北京： 化学工业出版社， 2015： 812.

[3] 徐杰. 汉桃叶的化学成分研究[D].湖南中医药大学，2006.

[4] 潘力，廖厚知，齐艳辉.HPLC测定汉桃叶中反-丁烯二酸的含量[J].辽宁中医杂志，2012，39（05）：906-907.

[5] 倪开勤，高效液相色谱法测定汉桃叶中有效成分含量[J].医药导报， 2013，32（8）： 1097-1098.

[6] 徐剑， 张永萍， 汉桃叶药材含量测定方法的研究[J].贵阳中医学院学报，2008，30（2）： 75-77

[7] 胡书平. 汉桃叶有机酸类成分研究及软膏剂开发[D].中央民族大学，2012.

[8] 司敏，人参皂苷CK的抗炎镇痛作用及相关机制[D].安徽医科大学， 2018.

[9] 谢昧，人参皂苷Rg1抗炎、镇痛作用及其作用机制[J].中国医院药学杂志，2013，19： 1592-1597.

胡楚璇，刘洁，郭小东.人参皂苷Rg_1镇痛抗炎实验研究[J].中药材，2013，36（03）：464-467.