李虹泽 曹锋 章敏

(武汉市金银潭医院 1检验科，湖北 武汉 430023；2外科)

近年研究发现，肺癌的发生与基因的异常表达有关，这些基因参与调控肺癌的进展和转移，也是近年来分子靶向治疗的研究热点〔1〕。研究发现，miRNA与肿瘤进展有关，参与调控肿瘤细胞的恶性增殖、转移等过程〔2〕。miR-20a是一个作用十分广泛的miRNA分子，在人类的多种组织和器官中均有表达，参与细胞的分化、增殖、凋亡等过程，与先兆子痫、类风湿关节炎等疾病进展有关〔3，4〕。研究报道，miR-20a还参与人类肿瘤的发生，沉默miR-20a具有抵抗白血病发生的作用，miR-20a在宫颈癌中高表达与肿瘤患者的预后有关，miR-20a具有促进前列腺癌恶性进展的作用〔5～7〕。研究显示，miR-20a在肺癌组织中的表达水平高于正常组织，其高表达可能与肺癌的进展有关〔8〕。目前对于miR-20a在肺癌细胞生物学特性中的作用尚不明确。本实验探讨miR-20a在肺癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭中的作用和机制，为靶向基因治疗肺癌提供新思路。

1 材料与方法

1.1材料 正常肺上皮细胞BEAS-2B和肺癌细胞A549、Spc-A1、H322购自上海歌凡生物细胞库；miRNA cDNA第一链合成试剂盒购自上海吉凯基因化学技术有限公司；基质金属蛋白酶(MMP)-9抗体、ZNF259抗体购自美国Invitrogen；本实验引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；miR-20a inhibitor、inhibitor control、miR-20a mimics、mimics control均由吉满生物科技(上海)有限公司合成构建；C-半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3抗体、MMP-2抗体、C-Caspase-9抗体购自美国Abcam；ZNF259 siRNA、siRNA control购自上海吉玛制药技术有限公司。

1.2Realtime PCR检测miR-20a在肺癌细胞中的表达水平 收集正常肺上皮细胞BEAS-2B和肺癌细胞A549、Spc-A1、H322，按照Trziol试剂提取各细胞中的总RNA。总RNA经紫外分光光度计测定其纯度及浓度后，进行逆转录反应，逆转录步骤同miRNA cDNA第一链合成试剂盒，cDNA合成条件为：16℃孵育30 min，42℃孵育30 min，80℃孵育15 min，4℃孵育10 min。使用SYBR Green进行定量PCR，PCR条件为：95℃孵育3 min，95℃孵育12 s，58℃孵育30s，共30个循环。把U6设置为内参，根据PCR过程中的CT值计算miR-20a水平，计算方法采用2-△△CT法。引物序列为：U6正义5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反义5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。miR-20a正义5′-GCGAGATCTAGTTGTGCAAATCTATGC-3′，反义5′-GGCGAATTCTAACCATAGAACAGTGTTC-3′。

1.3细胞转染 在肺癌细胞中分别转染miR-20a inhibitor和inhibitor control，转染试剂用Lipofectamine 2000，转染操作同转染试剂说明。将转染miR-20a inhibitor和inhibitor control后的细胞命名为Anti-miR-20a和Anti-NC。把没有转染的细胞命名为Control。在细胞转染后1 d，按照1.2中Realtime PCR方法测定下调效果。

1.4四甲基偶氮唑蓝(MTT)方法测定细胞增殖变化 按照Control、Anti-NC、Anti-miR-20a分组方法将肺癌细胞按照每孔100 μl的细胞悬浮液接种到96孔板中，细胞培养1 d后，在细胞中添加MTT溶液(体积15 μl)，放在37℃，5% CO2培养箱中培养4 h。将孔内的上清液体吸弃，添加150 μl二甲基亚砜(DMSO)溶液，摇床震荡反应10 min。以不含细胞的孔调零以后，在酶标仪上检测波长470 nm的OD值。

1.5流式细胞仪测定细胞凋亡变化 取培养1 d后的Control、Anti-NC、Anti-miR-20a细胞，每组收集约106个细胞，添加磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤1次细胞，最后用结合缓冲液将细胞悬浮，再依次添加PI和Annexin V-FITC染液各5 μl。在60min内用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.6Transwell小室测定细胞侵袭和迁移变化 细胞侵袭和迁移实验均用Transwell小室，侵袭实验前用基质胶将小室湿化，迁移实验不用基质胶湿化，其余步骤相同。步骤如下：将Control、Anti-NC、Anti-miR-20a细胞悬浮在不含血清的培养液中，吸取200 μl添加到8 μm孔径的Transwell小室的上室中，在下室中添加600 μl含血清细胞培养液。培养1 d后，用甲醇固定细胞30 min，结晶紫染色后，在显微镜下随机选取5个视野统计穿膜细胞数目。

1.7Western印迹检测细胞中C-Caspase-3、MMP-2、C-Caspase-9、MMP-9蛋白表达变化 常规方法使用蛋白裂解试剂提取Control、Anti-NC、Anti-miR-20a(培养1 d)细胞总蛋白。蛋白定量方法为二喹啉甲酸(BCA)法，定量步骤同试剂盒。将蛋白同上样缓冲液混合煮沸，添加到十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上样孔中，每个孔按照40 μg蛋白样品计算。SDS-PAGE用10%分离胶和5%浓缩胶。在分离胶中采用90 V电压电泳，在浓缩胶中采用100 V电压电泳。在90 V电压条件下将凝胶上的蛋白转移到裁剪合适大小的NC膜上。NC膜经过含有5%牛血清白蛋白(BSA)的封闭液在室温中封闭90 min后，再与一抗反应液(C-Caspase-3按照1∶400稀释、C-Caspase-9按照1∶400稀释、MMP-2按照1∶800稀释、MMP-9按照1∶800稀释)在室温中孵育90 min。最后将NC膜放在1∶4 000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗中，在室温中孵育1 h。以ECL显色，Image J分析条带的灰度值，把β-actin作为内参，分析目的蛋白表达变化。

1.8miR-20a靶基因预测和鉴定 经过生物信息学软件发现miR-20a与ZNF259的3′UTR端有结合位点，将ZNF259的3′UTR端结合位点突变，构建突变型(MUT)荧光素酶报告载体(pmiRGLO)，同时构建含有ZNF259的3′UTR野生型(WT)荧光素酶报告载体。把WT和MUT分别用miR-20a mimics和 mimics control共转染到肺癌细胞中，用双荧光素酶活性报告测定试剂盒检测荧光素酶活性。用Western印迹方法检测Control、Anti-NC、Anti-miR-20a(培养1 d)细胞中ZNF259蛋白表达变化，步骤同上。

1.9ZNF259 siRNA对下调miR-20a的肺癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的影响 将miR-20a inhibitor、ZNF259 siRNA和miR-20a inhibitor、siRNA control共转染到肺癌细胞中，命名为Anti-miR-20a+si-ZNF259、Anti-miR-20a+si-NC。按照上述步骤以MTT、流式细胞仪、Transwell小室、Western印迹检测细胞增殖、凋亡、侵袭迁移和C-Caspase-3、C-Caspase-9、MMP-2、ZNF259、MMP-9蛋白表达变化。

1.10统计分析 采用SPSS21.0软件进行t检验、单因素方差、SNK-q检验。

2 结 果

2.1miR-20a在肺癌细胞中高表达 肺癌细胞A549、Spc-A1、H322中miR-20a表达水平(1.89±0.13、1.40±0.12、2.36±0.23)明显高于正常肺上皮细胞BEAS-2B(1.00±0.09，P<0.05)，且H322细胞中miR-20a表达水平明显高于Spc-A1、A549(P<0.05)。miR-20a在肺癌细胞中高表达，选用表达水平最高的H322细胞作后续实验。

2.2miR-20a inhibitor下调肺癌细胞中miR-20a表达 Anti-miR-20a组miR-20a表达水平(0.32±0.03)明显低于Anti-NC组(0.98±0.11，P<0.05)，Control组(1.00±0.10)与Anti-NC组、Anti-miR-20a组比较差异有统计学意义(F=58.591，P=0.000)。miR-20a inhibitor下调肺癌细胞中miR-20a表达水平。

2.3下调miR-20a对肺癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移和C-Caspase-3、C-Caspase-9、MMP-2、MMP-9蛋白的影响 在肺癌细胞中转染miR-20a inhibitor，细胞增殖能力降低，凋亡率升高，细胞迁移和侵袭数目减少，细胞中促凋亡蛋白C-Caspase-3、C-Caspase-9表达水平升高，肿瘤转移促进因子MMP-2、MMP-9蛋白水平下降，差异均有统计学意义(均P<0.05)。见图1，图2，表1。

表1 各组OD值、凋亡率、侵袭数目、迁移数目和C-Caspase-3、C-Caspase-9、MMP-2、MMP-9蛋白表达

图2 流式细胞仪方法检测肺癌细胞凋亡率

图1 Western印迹方法检测C-Caspase-3、C-Caspase-9、MMP-2、MMP-9蛋白表达

2.4miR-20a靶向调控ZNF259表达 miR-20a与ZNF259的3′UTR端有碱基互补结合位点(图3)，且WT和miR-20a mimics共转染后的肺癌细胞荧光素酶活性(0.37±0.06)显著低于mimics control组(1.00±0.12;t=8.133,P=0.001)。而MUT和miR-20a mimics共转染后(0.99±0.11 vs 1.00±0.88)无明显变化(t=0.127，P=0.905)。

图3 miR-20a与ZNF259的3′UTR端结合位点

2.5miR-20a inhibitor促进ZNF259表达 转染miR-20a inhibitor后的肺癌细胞中ZNF259蛋白水平(0.79±0.09)明显高于Anti-NC组(0.47±0.6，P<0.05)。Control组(0.50±0.07)与Anti-NC组、Anti-miR-20a组差异有统计学意义(F=16.934，P=0.003),见图4。

图4 Western印迹检测miR-20a inhibitor对肺癌细胞中ZNF259蛋白表达的影响

2.6ZNF259 siRNA逆转下调miR-20a对肺癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响 与转染miR-20a inhibitor、siRNA control的肺癌细胞比较，共转染miR-20a inhibitor、ZNF259 siRNA后的肺癌细胞增殖能力升高，细胞凋亡率降低，细胞迁移和侵袭数目增多，细胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9蛋白水平降低，MMP-2、MMP-9蛋白水平升高，ZNF259蛋白水平下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图5，表2，图6。

图5 流式细胞仪检测细胞凋亡

表2 ZNF259 siRNA和miR-20a inhibitor共转染对肺癌细胞OD值、凋亡率、侵袭数目、迁移数目和C-Caspase-3、C-Caspase-9、MMP-2、MMP-9、ZNF259蛋白表达的影响

图6 Western印迹方法检测细胞中C-Caspase-3、C-Caspase-9、MMP-2、ZNF259、MMP-9蛋白表达

3 讨 论

miR-20a是具有调节多种细胞如成骨细胞、内皮细胞生长、分化的调节因子，不仅与正常组织生长和胚胎发育有关，还参与人类疾病的发生〔9，10〕。目前已经发现miR-20a在皮肤损伤等相关疾病中发挥重要调节作用，对于miR-20a在肿瘤中的作用是目前研究的热点〔11〕。在胃癌中证实，miR-20a具有增加胃癌细胞顺铂抵抗性的作用，miR-20a表达下调可以促进胃癌细胞凋亡发生〔12〕。miR-20a高表达促进卵巢癌细胞转移〔13〕。研究报道，miR-20a在肺癌组织中的阳性率明显高于对应癌旁组织，且其表达水平的高低与肿瘤患者临床病理分期有关〔14〕。本实验结果说明下调miR-20a抑制肺癌细胞恶性表型，靶向抑制miR-20a可能是治疗肺癌的有效途径。

肿瘤细胞恶性表型与细胞内相关蛋白表达有关，这些蛋白受到细胞内调控基因的直接或间接调节作用〔15〕。Caspase蛋白家族是目前已经发现的与细胞凋亡关系最为密切的凋亡调节蛋白，其受到凋亡信号影响后可以通过自我活化的方式诱导Caspase凋亡反应，最终促进细胞凋亡发生〔16〕。Caspase-3和Caspase-9是凋亡反应的下游和上游因子，只有被激活形成C-Caspase-3和C-Caspase-9后才可以发挥凋亡促进作用〔17〕。MMP-9和MMP-2具有降解细胞外基质的作用，也是目前为止发现的与肿瘤转移关系最为密切的基质降解酶〔18〕。本研究结果说明下调miR-20a抵抗肺癌细胞转移并诱导细胞凋亡发生，与检测细胞凋亡和侵袭、迁移能力结果相符合。

目前对于miRNA分子调控机制的研究显示，miRNA分子通过靶向调控下游基因的表达发挥生物学作用，且在不同组织或生理、病理过程中，同一个miRNA分子的靶向调控机制不同〔19〕。miR-20a作为一个与肿瘤有关的miRNA分子，目前在不同的肿瘤中已经证实其具有多个靶基因，如PTEN、ABL2等〔20，21〕。本实验发现ZNF259可能是miR-20a的靶基因，且ZNF259受到miR-20a的负调控作用。研究报道，ZNF259具有抑制肺癌细胞增殖、侵袭的作用，ZNF259在肺癌进展中发挥抑制作用〔22〕。本实验发现，下调ZNF259具有逆转下调miR-20a抗肺癌细胞的作用，说明miR-20a通过靶向ZNF259调控肺癌细胞恶性表型。

综上，miR-20a在肺癌进展及恶性转移过程中可能发挥促进作用，其在肺癌细胞中高表达，下调miR-20a具有抑制肺癌细胞恶性表型并诱导细胞凋亡的作用，其作用机制与靶向调控ZNF259有关。