张慧　黄立中　肖玉洁　 邓天好　龚辉

[摘要] 目的 基于異黏蛋白（MTDH）基因探讨黄芩苷对4T1细胞增殖、迁移、侵袭的影响。 方法 取对数生长期的4T1细胞，分为对照组，25、50、100、150、200 mg/L黄芩苷组，分别采用对应药物处理4T1细胞，MTT法检测黄芩苷处理后的细胞活性，细胞划痕实验、Transwell法测定细胞迁移力、侵袭力，Western blot检测细胞中MTDH表达水平。 结果 25 mg/L黄芩苷对细胞迁移影响不明显，随着浓度增大到50 mg/L，迁移抑制作用逐渐明显，到100、150 mg/L时，表现出明显的抑制作用，但药物作用24、48 h后，对细胞无明显迁移抑制作用。不同浓度黄芩苷组间细胞侵袭抑制率比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。其中150 mg/L黄芩苷组细胞侵袭抑制率高于100 mg/L黄芩苷组（P < 0.05）。100、150 mg/L黄芩苷组细胞侵袭抑制率高于50 mg/L黄芩苷组，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。与对照组比较，50、100、150 mg/L黄芩苷组MTDH表达量降低（P < 0.05或P < 0.01）。 结论 黄芩苷能抑制乳腺癌细胞生长和增殖，抑制乳腺癌细胞的迁移能力和侵袭能力，其机制可能与下调MTDH的表达相关。

[关键词] 黄芩苷;异黏蛋白;增殖;侵袭;迁移

[中图分类号] R737.9          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）08（c）-0016-05

Effect study on MTDH mediated baicalin inhibiting proliferation， migration and invasion of 4T1 breast cancer cells

ZHANG Hui1   HUANG Lizhong2   XIAO YuJie2   DENG Tianhao3   GONG Hui3

1.Department of Medical Oncology， Chinese Medicine Hospital of Hainan Province， Hainan Province， Haikou   570203， China; 2.College of Combination of Chinese and Western Medicine， Hu′nan University of Chinese Medicine， Hu′nan Province， Changsha   410007， China; 3.Department of Medical Oncology， Hu′nan Academy of Traditional Chinese Medicine Affiliated Hospital， Hu′nan Province， Changsha   410006， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of baicalin on proliferation， migration and invasion of 4T1 cells based on metadherin （MTDH） gene. Methods 4T1 cells in logarithmic growth stage were divided into blank control group and baicalin group with different doses of 25， 50， 100， 150 mg/L and 200 mg/L， and then treated with corresponding drugs. Cell activity after baicalin treatment was detected by MTT method. Migration was measured by scratch assay. Invasion was measured by transwell assay and MTDH expression in cells was measured by Western blot. Results The effect of baicalin at 25 mg/L on cell migration was not obvious. As the concentration increased to 50 mg/L， the inhibition of cell migration gradually became obvious. When the concentration increased to 100 mg/L and 150 mg/L， the inhibition of cell migration showed obvious effects. The inhibition rate of cell invasion of baicalin groups with different concentrations was statistically significant （P < 0.05）. The inhibition rate of cell invasion in the group of 150 mg/L baicalin was higher than that in the group of 100 mg/L baicalin （P < 0.05）. The inhibition rate of cell invasion in the 100 mg/L and 150 mg/L baicalin group was higher than that in the 50 mg/L baicalin group， and the differences were highly statistically significant （P < 0.01）. Compared with the control group， MTDH expression was decreased in the 50， 100 mg/L  and 150 mg/L baicalin groups （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Baicalin can inhibit the growth and proliferation of 4T1 breast cancer cells， inhibit the migration and invasion ability of breast cancer cells， and its mechanism may be related to the down-regulation of MTDH expression.

[Key words] Baicalin; Metadherin; Proliferation; Migration; Invasion

乳腺癌發病率位居女性恶性肿瘤的首位[1]，具有发病率高、侵袭率强、极易复发和转移的特点。复发转移是导致乳腺癌患者死亡的主要原因[1-2]。研究显示[3-5]，异黏蛋白（MTDH）基因过表达能促进乳腺癌细胞往肺、骨、脑等器官侵袭转移的能力。黄芩是一种广泛使用的中草药，主要成分为黄芩苷已被证实具有广谱抗肿瘤作用，本课题组前期采用黄芩苷联合黄芩素进行体外实验[6]，发现其能抑制乳癌细胞生长、诱导乳腺癌细胞凋亡，抑制乳腺癌细胞的侵袭能力[7]。而黄芩苷在多种中药中可提取，对临床指导及使用意义更大。因此本研究探讨黄芩苷对乳腺癌细胞侵袭迁移的影响及机制，为寻找低价安全有效的抗癌药物提供新思路。

1 材料与方法

1.1 肿瘤细胞株

4T1乳腺癌细胞株在BALB/c裸鼠中的生长转移特性与人体中的乳腺癌十分接近，注射后能产生高转移肿瘤，转移至肺、肝等部位。该细胞株由中南大学湘雅医学院细胞中心提供。

1.2 实验药物及试剂

黄芩苷：纯度98.6%，批号：110715-201416，购自中国药品生物制品检定所，用DMSO溶解，配成200 mg/L备用。胎牛血清、DMEM培养液：美国Hyclone公司;胰酶：美国Invitrogen公司;DMSO：美国Xiasi生物公司;MTT：美国Sigma公司;MTDH兔抗人单克隆抗体：美国Proteintech，货号13860-1-AP。完全培养液的配置：10%胎牛血清、1%双抗加入高糖DMEM培养液中，随用随配。

1.3 主要仪器

SW-CJ-1CV超净工作台：苏净安泰公司;倒置光学显微镜：重庆光学仪器厂;TDZ5-40台式离心机：长沙天创仪器公司;Transwell小室：Costar公司;6孔板：NEST;SHEL-LABCO2培养箱：日本Hitachi公司;GG112-10B恒温水浴箱：上海医疗器械厂。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养及传代  4T1细胞培养于完全培养液中，37℃、5%CO2饱和湿度的恒温培养箱中培养，每日于倒置显微镜下观察细胞形态，待细胞生长达90%左右进行传代。

1.4.2 MTT法测细胞生长抑制率  将对数生长期的细胞以1×104个/孔铺于96孔板，分为对照组，25、50、100、150、200 mg/L黄芩苷组，对照组仅加入相应体积的培养液，黄芩苷组加入不同浓度的黄芩苷，每一浓度设6个平行孔，恒温培养箱培养48 h，吸出上清，每孔加入无血清DMEM培养液溶解的MTT 20 μL（5 mg/mL），孵育4 h，吸出上清，以DMSO溶解蓝紫色颗粒，在酶标仪490 nm处测量各孔的吸光度值（OD），再计算细胞抑制率。细胞抑制率=[1-（OD药物-OD对照组）/（OD细胞-OD对照组）]×100%。

1.4.3 细胞划痕实验  按密度为5×105个/孔将4T1细胞悬液接种到6孔板，每孔加入2 mL完全培养液，恒温培养箱中培养24 h，观察细胞呈单层生长至80%，用无菌的10 μL移液器枪头沿着细胞孔的中轴线轻轻划过（肉眼<1 mm），PBS缓冲液轻轻冲洗，洗去细胞残骸，分为对照组和25、50、100、150 mg/L黄芩苷组，黄芩苷各组加入相应浓度的黄芩苷2 mL，对照组加入2 mL完全培养液，继续培养24 h。用倒置光学显微镜观察细胞迁移情况（100×），每组细胞均设2个平行孔，拍照记录。

1.4.4 Transwell侵袭实验  向已铺Matrigel胶的Transwell细胞培养板上室中加入200 μL含浓度为25、50、100、150 mg/L黄芩苷的单细胞培养液（含细胞4×104个），Transwell细胞培养板下室加入完全培养液600 μL，恒温培养箱培养24 h。取出Transwell小室，用棉签擦掉小室的Matrigel胶和未穿膜的细胞，4%多聚甲醛固定10 min，用浓度0.1%结晶紫染色10 min，洗掉溶液中的结晶紫后在倒置光学显微镜下（200×），每组计数5个不同视野中的细胞数目。侵袭抑制率=（1-实验组侵袭细胞数/对照组侵袭细胞数）×100%。

1.4.5 Western blot检测MTDH表达  铺于6孔板内的4T1细胞生长至60%采用药物处理，分为对照组和50、100、150 mg/L黄芩苷组。对照组予以完全培养液，黄芩苷各组给予不同浓度黄芩苷培养24 h，离心收集细胞，加入细胞裂解液并轻轻摇晃培养瓶，使裂解液和细胞充分接触，提取总蛋白后进行电泳、转膜，加入MTDH一抗、二抗孵育后ECL显色曝光，Quantity One专业灰度分析软件进行分析。

1.6 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件分析数据。计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两两比较采用t检验，多组比较采用方差分析（ANOVA）;等级资料两样本相关性检验用Spearman等级相关分析法。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT法测黄芩苷对4T1细胞活力的影响

25、50、100 mg/L浓度下，24、48 h两个时间点黄芩苷对4T1细胞活力的影响不明显。黄芩苷浓度增加到150、200 mg/L，48 h的细胞抑制率分别为40%和68%，明显抑制细胞的生长。基于这一阶段的MTT实验，考虑到高浓度黄芩苷（200 mg/L）对乳腺癌细胞活性的抑制作用，为了排除后续实验中黄芩苷对4T1乳腺癌迁移和侵袭作用是由抑制细胞活性引起的，后续实验采用25、50、100、150 mg/L黄芩苷。见图1、表1。

2.2 不同浓度黄芩苷对4T1细胞迁移能力的作用

25 mg/L黄芩苷对细胞迁移影响不明显，随着浓度的增大到50 mg/L，迁移抑制作用逐漸明显，到100、150 mg/L时，表现出明显的抑制作用，但药物作用24、48 h后，对细胞无明显迁移抑制作用。见图2。

2.3不同浓度黄芩苷对4T1细胞侵袭抑制作用

与对照组比较，25 mg/L黄芩苷组细胞侵袭能力差异无统计学意义（P > 0.05），50、100、150 mg/L黄芩苷组Transwell小室下面的细胞数均少于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。不同浓度黄芩苷组间细胞侵袭抑制率比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。其中150 mg/L黄芩苷组细胞侵袭抑制率高于50、100 mg/L黄芩苷组（P < 0.05）。100mg/L黄芩苷组细胞侵袭抑制率高于50 mg/L黄芩苷组，差异有统计学意义（P < 0.01）。见图3～4。

与对照组比较，△P < 0.05;与50 mg/L黄芩苷组比较，*P < 0.05;与100 mg/L黄芩苷组比较，#P < 0.05

2.4黄芩苷对4T1细胞蛋白表达的影响

与对照组比较，50、100、150 mg/L黄芩苷组MTDH表达量降低（P < 0.05或P < 0.01）。见表2、图5。

3 讨论

MTDH[8-9]是一个定位于8号染色体长臂2区2带的原癌基因。既往在4种不同乳腺癌细胞株中均检测到MTDH表达[10]。采用shRNA干扰乳腺癌细胞MTDH表达[11]，发现乳腺癌侵袭能力降低，而对复发转移乳腺癌患者瘤组织中MTDH检测发现，其表达明显高于原发乳腺癌患者[12]，提示MTDH过表达与乳腺癌侵袭转移密切相关[13]。前期在动物实验中对乳腺癌组织中MTDH表达及其与肺转移相关性研究中发现，MTDH与乳腺癌肺转移密切相关[14]。

黄芩苷分子式C21H18O11，在常用中药黄芩、半枝莲、灯盏细辛等药材中均可以提取到，是中药黄芩发挥功效的主要物质基础之一，在黄芩中含量高达9%[15-16]。黄芩苷除传统报道抗炎、抗病毒及解热护肝作用外，对肝癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤具有抗瘤作用[17-18]。黄芩苷可以通过逆转上皮细胞间质转化从而有效抑制乳腺癌的转移[19]。课题组前期研究证实，黄芩苷具有抑制乳腺癌细胞生长、诱导乳腺癌细胞凋亡，抑制乳腺癌细胞的侵袭能力[6-7]。

本研究MTT实验证实了黄芩苷对细胞活性的抑制作用，提示黄芩苷可以有效的抑制乳腺癌细胞生长和增殖。迁移能力和侵袭能力是肿瘤细胞转移过程中必须具备的两个基本条件[20]。划痕及Transwell实验发现，黄芩苷能减弱4T1乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力。进一步检测黄芩苷干预后各组MTDH表达发现，MTDH的表达在黄芩苷各组均有不同程度的下调，提示黄芩苷抑制乳腺癌细胞增殖、侵袭迁移的机制可能与下调MTDH的表达相关，从细胞实验层次为黄芩苷抗乳腺癌侵袭转移提供了理论依据。根据这一结论，本课题组已经开展黄芩苷抗乳腺癌细胞侵袭转移的体内实验，以期进一步研究黄芩苷的疗效和MTDH相关调节机制。

[参考文献]

[1]  Zhang H，Zhu W，Biskup E，et al. Incidence，risk factors and prognostic characteristics of bone metastases and skeletal-related events（SREs） in breast cancer patients：A systematic review of the real world data [J]. J Bone Oncol，2018，11：38-50.

[2]  Nayak D，Katoch A，Sharma D，et al. Indolylkojyl methane analogue IKM5 potentially inhibits invasion of breast cancer cells via attenuation of GRP78 [J]. Breast Cancer Res Treat， 2019，177（2）：307-323.

[3]  Yu L，Di Y，Xin L，et al. SND1 acts as a novel gene transcription activator recognizing the conserved Motif domains of Smad promoters，inducing TGFβ1 response and breast cancer metastasis [J]. Oncogene，2017，36（27）：3906-3914.

[4]  Juan Xu，Yeying Wang，Zhizheng Li，et al. Ultrasound-Targeted Microbubble Destruction （UTMD） Combined with Liposome Increases the Effectiveness of Suppressing Proliferation，Migration，Invasion，and Epithelial-Mesenchymal Transition（EMT） via Targeting Metadherin （MTDH） by ShRNA [J]. Med Sci Monit，2019，25：2640-2648.

[5]  Li T，Li Y，Sun H. MicroRNA-876 is sponged by long noncoding RNA LINC00707 and directly targets metadherin to inhibit breast cancer malignancy [J]. Cancer Manag Res，2019，11：5255-5269.

[6]  王婷，黄立中，肖玉洁，等.黄芩苷联合黄芩素诱导乳腺癌细胞凋亡的机制研究[J].中国现代药物应用，2012，6（9）：10-11.

[7]  Wanjun Y，Xingcong M，Xiaoyan G，et al. Research progress in the correlation between baicalein and the invasion and metastasis of breast cancer [J]. Modern Oncology，2016，24（3）：491-494.

[8]  Chen X，Li XY，Long M，et al. The FBXW7 tumor suppressor inhibits breast cancer proliferation and promotes apoptosis by targeting MTDH for degradation [J]. Neoplasma，2018，65（2）：201-209.

[9]  Wang Zhao，Zheng-Yan Tang，Zhuo Yin，et al. Metadherin regulates epithelial mesenchymal transition in carcinoma [J]. Onco Targets Ther，2016，9：2429-2436.

[10]  李超，宋振川，王新樂，等.异黏蛋白在乳腺癌细胞中的表达[J].中华实验外科杂志，2013，30（12）：62-63.

[11]  Liu ZZ，Cao H，Ding YZ，et al. Mechanism research on influence of down-regulating MTDH gene expression in breast canser cell metastasis [J]. Chin J Canser Prev Treat，2014，21（8）：575-579.

[12]  Jin PX，Liu ZJ. Expression of metadherin gene in metastatic breast cancer and its clinical significance [J]. Academy Journal of Chinese PLA Medical School，2013，34（2）：133-136.

[13]  Dhiman G，Srivastava N，Goyal M，et al. Metadherin：A Therapeutic Target in Multiple Cancers [J]. Front Oncol，2019，9：349.

[14]  冯磊，毛丹，陈州华，等.转移黏附基因在乳腺癌组织中的表达及其与肺转移的相关性研究[J].中南药学，2017， 15（4）：416-420.

[15]  周伟，庾国桢，刘亚敏，等.黄芩苷通过IκBα/NF-κB通路调节Aβ25-35诱导的HT22细胞凋亡[J].中成药，2019，41（11）：2765-2769.

[16]  郑勇凤，王佳婧，傅超美，等.黄芩的化学成分与药理作用研究进展[J].中成药，2016，38（1）：141-147.

[17]  张艳丽，王聪，朱雷蕾，等.黄芩苷药理作用研究进展[J].河南中医.2019，39（9）：1450-1454.

[18]  盂璐，张学武，李正禄.黄芩苷诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡及对相关蛋白表达的影响[J].时珍国医国药，2010， 21（9）：2212.

[19]  Zhou T，Zhang A. Baicalin inhibits the metastasis of highly aggressive breast cancer cells by reversing epithelial-to-mesen-chymal transition by targeting β-catenin signaling [J]. Oncol Rep，2017，38（6）：3599-3607.

[20]  Christofori G. New signals from the invasive front [J]. Nature，2006，441（7092）：444-450.

（收稿日期：2019-10-24）

[基金项目] 湖南省教育厅一般项目（17C1205）;海南省省级中医重点专科建设项目（肿瘤科）（S100111.401）;海南省自然科学基金面上项目（817338）。

[作者简介] 张慧（1985.2-），女，博士;研究方向：恶性肿瘤的中西医结合防治。

[通讯作者] 龚辉（1986.6-），女，博士，在站博士后;研究方向：恶性肿瘤的中西医结合防治。