王舒琪，忻晓东，顿佳颖，李春花，3*

(1.河北中医学院药学院药剂学教研室，河北 石家庄 050090； 2.涿州市医院，河北 保定 072750;3.河北省高校中药组方制剂应用技术研发中心，河北 石家庄 050090)

溶解度是影响药物有效成分溶出的关键因素，中药材中存在很多药理活性强但因溶解度小而限制了其临床应用，影响临床效果的成分[1]。有研究表明中药复方配伍以中医药理论为指导，可利用特定药材如甘草自身成分具有增溶的性质增加难溶性成分溶解度。李鸣[2]曾以四君子汤为例，比较药材单煎液、药材与甘草合煎液中水溶出物的量，表明甘草具有增溶作用。甘草作为中医常用药物之一，始载于《神农本草经》，具有补脾益气、缓急止痛、清热解毒、祛痰止咳、调和诸药等功效，主要有效成分为甘草酸，属于三萜皂苷，具有表面活性剂的性质[3]能够增强合煎液中其它药材难容性成分的溶解度。研究表明，甘草的增溶原理基于甘草酸可形成胶束[4]。

桃核承气汤原方出自《伤寒论》，作为活血祛瘀的代表方及经典名方之一，主治下焦蓄血症，可逐瘀泻热，其临床应用广泛，具有确实的疗效，可用于治疗急性脑卒中、多发性脑梗塞、脑出血术后并发症、糖尿病并发脑梗死、肝性脑病等由瘀热互结所致疾病[5]。该方组方精简，由桃仁、大黄、桂枝、甘草、芒硝组成。现代研究及临床应用研究表明[6-9]，桃核承气汤中发挥其药理作用的成分主要为苦杏仁苷、桂皮醛、甘草酸、大黄酸、大黄素及大黄酚等蒽醌类成分。本实验为验证甘草增溶原理，以桃核承气汤为例，分别计算桃仁(S1)、大黄(S2)、桂枝(S3)、甘草(S4)单煎液；桃仁+甘草(S5)、大黄+甘草(S6)、桂枝+甘草(S7)合煎液；桃仁+大黄+桂枝(S8)合煎液；桃仁+大黄+桂枝+甘草(S9)合煎液的油水分配系数，并采用高效液相色谱法对药材的单煎液与合煎液进行有效成分含量测定。

1 仪器与试药

LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司)；TG328B型电子分析天平(上海精科仪器厂)；KQ-100E型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；RE-52型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；FD-1-50冷冻干燥机(北京博医康实验仪器有限公司)。

苦杏仁苷(批号：Z1709131，成都草源康生物科技有限公司，纯度：98.00%)；大黄酸(批号：MUST-11032801，成都曼斯特生物科技有限公司，纯度：98.00%)；大黄素(批号：MUST-12022715，成都曼斯特生物科技有限公司，纯度：98.00%)；大黄酚(批号：20120320，上海源叶生物科技有限公司，纯度：98.00%)；芦荟大黄素(批号：20120412，上海源叶生物科技有限公司，纯度：98.00%)；大黄素甲醚(批号：PF0223SA13，上海源叶生物科技有限公司，纯度：98.00%)；桂皮醛(批号：H02M6Q1，上海源叶生物科技有限公司，纯度≧98.00%)；甘草酸(批号：MUST-17032205，成都曼斯特生物科技有限公司，纯度：99.55%)； SAS 67120型超纯水系统(法国Millipore公司)；正辛醇(分析纯，天津市津东天正精细化学试剂厂)；乙腈(色谱纯，天津市康科德科技有限公司)；甲醇(色谱纯，天津市大茂化学试剂厂)；磷酸(分析纯，天津光复科技发展有限公司)。

药材均购于河北省石家庄市乐仁堂药店，经河北中医学院侯芳洁老师鉴定桃仁为蔷薇科植物桃Prunuspersica(L.) Batsch 的干燥成熟种子，大黄为廖科植物掌叶大黄RheumpalmatumL.的干燥根及根茎，桂枝为樟科植物肉桂CinnamomumcassiaPresl的干燥嫩枝，甘草为豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根及根茎。

2 方法与结果

2.1 油水分配系数的测定

2.1.1 单味药材的提取与浸出物的测定

按处方比例分别称取桃仁1.5 g(S1)、大黄6 g(S2)、桂枝3 g(S3)、甘草3 g(S4)，置于250 mL圆底烧瓶中，加10倍量的水，回流提取3次，时间为65 min、32.5 min、32.5 min，过滤[10]，收集滤液。合并3次收集的滤液，将滤液浓缩至30 mL。取浓缩液10 mL，置于80 ℃水浴锅蒸发至稠浸膏状态，放入冰箱中，于-25 ℃预冻10 h，冷冻干燥成干浸膏，称重。另取10 mL浓缩液，加10 mL正辛醇萃取，分离油相与水相，同法制成干浸膏，称重。

2.1.2 单味药材加甘草提取与浸出物的测定

按处方比例分别称取桃仁1.5 g+甘草3 g(S5)、大黄6 g+甘草3 g(S6)、桂枝3 g+甘草3 g(S7)进行提取与浸出物的测定，提取与测定方法同上述“2.1.1”项单味药材的提取与测定。

2.1.3 复方提取与浸出物的测定

按处方比例称取全方药材一付(不含芒硝与甘草)即：桃仁1.5 g,大黄6 g,桂枝3 g(S8) ，另取一付药材(不含甘草)即：桃仁1.5 g,大黄6 g,桂枝3 g,甘草3 g(S9)，分别对以上两个复方进行提取与浸出物的测定，提取与测定方法同上述“2.1.1”项单味药材的提取与测定。

2.1.4 油水分配系数的计算

依据油水分配系数的公式即logP=log(W油/W水)，其中W油为油相浸膏质量，W水为水相浸膏质量，对实验所得数据进行计算，结果见表1。结果表明不含甘草药材的油水分配系数均大于含甘草药材的油水分配系数，说明了桃核承气汤中甘草能够增加其它药物成分在水中溶解度。

表1 油水分配系数结果

2.2 指标成分含量测定

2.2.1 液相条件

色谱柱为 Diamonsil C18(5 μm,250 mm×4.6 mm)，流动相为乙腈和0.1%磷酸水溶液，梯度洗脱：0～5 min，15%乙腈；5～10 min，15%～20%乙腈；10～30 min，20%乙腈；30～55 min，20%～50%乙腈；55～70 min，50%乙腈；70～85 min，50%～80%乙腈；85～90 min，80%～100%乙腈；90～95 min，100%乙腈；体积流量1.0 mL/min ；进样量10 μL；柱温30 ℃；苦杏仁苷检测波长为210 nm，大黄素、大黄素甲醚、芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚、甘草酸检测波长为250 nm，桂皮醛检测波长为290 nm。

2.2.2 供试品溶液制备

精密吸取“2.1.1”项下剩余浓缩液1 mL置于5 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容，摇匀静置，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得单味药材供试品溶液。同理，取“2.2.2”项和“2.2.3”项的浓缩液，按上述操作，即得单味药材加甘草、复方的供试品溶液。

2.2.3 对照品溶液制备

分别称取苦杏仁苷、桂皮醛、甘草酸、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素适量，各置于5 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成质量浓度分别为0.278、0.554、1.234、0.236、0.264、0.258、0.244、0.242 mg/mL的对照品储备液。依次取上述对照品储备液2、1、2、1、1、1、1、1 mL，置于同一10 mL容量瓶中，即得混合对照品溶液。

2.2.4 专属性试验

精密吸取“2.2.2”项供试品溶液及“2.2.3”项混合对照品溶液各 10 μL，按“2.2.1”项下色谱条件测定，结果显示，各成分分离度良好，理论塔板数以苦杏仁苷峰计不低于3 000，说明该方法专属性强。色谱图见图1。

注：A.桃仁;B.桃仁+甘草;C.大黄;D.大黄+甘草;E.桂枝;F.桂枝+甘草;G.甘草;H.混标;1.苦杏仁苷;2.芦荟大黄素;3.大黄酸;4.大黄素;5.大黄酚;6.大黄素甲醚;7.甘草酸;8.桂皮醛

2.2.5 线性关系的考察

精密量取混合对照品溶液1、5、10、15、20 μL，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积。以进样量(x，μg)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程与线性范围见表2。

表2 回归方程与线性范围(n=5)

2.2.6 精密度试验

精密吸取混合对照品溶液，分别在确定的色谱条件下重复进样6次，记录峰面积。苦杏仁苷、桂皮醛、甘草酸、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素峰面积的RSD分别为0.390 9%、0.258 5%、0.119 2%、0.416 2%、0.307 2%、0.337 0%、0.455 0%、0.236 9%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.2.7 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于室温放置0、2、4、6、8、12 h，按所确定的色谱条件进样，记录峰面积。结果苦杏仁苷、桂皮醛、甘草酸、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素峰面积的RSD分别为0.276 6%、0.246 0%、0.225 0%、0.203 0%、0.858 4%、0.262 4%、0.857 3%、0.591 2%，表明供试品在12 h内稳定。

2.2.8 重复性试验

取同一供试品溶液，按所确定的方法平行制备6份，在“2.2.1”项色谱条件下进样，记录峰面积并计算含量。结果苦杏仁苷、桂皮醛、甘草酸、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素含量的RSD分别为0.326 7%、0.562 1%、0.232 8%、0.323 8%、0.471 8%、0.172 3%、0.399 3%、0.271 3%，表明该方法重复性良好。

2.2.9 加样回收率试验

精密量取已知含量供试品溶液6份，每份0.1 mL，按照100%分别加入 8 种化合物对照品，制备供试品溶液，再按上述色谱条件进行测定，记录峰面积，并计算各成分的加样回收率，结果苦杏仁苷、桂皮醛、甘草酸、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素的平均加样回收率范围在99.21%～100.60%，RSD均小于3%，表明该方法准确可靠。

2.2.10 样品含量测定

按上述“2.1.1”项下条件进行提取，“2.2.2”项制备供试品溶液，“2.2.1”项色谱条件进行测定，记录峰面积并计算含量，结果见表3。由表3可知，单味药材加甘草后的和煎液中除甘草酸外指标成分含量均高于单味药材煎液中指标成分的含量，甘草酸的含量降低，进而说明甘草酸可以通过形成胶束来增大其他成分在水中的溶解度[4]。

表3 样品含量测定结果

3 讨论

3.1 甘草增溶原理

查阅参考文献可知[11-13]，甘草中的甘草酸可通过形成胶束来发挥增溶作用，甘草酸具有表面活性剂的性质，存在亲水亲油两亲性结构，当其浓度达到临界胶束浓度时，亲水基团向外与水相相连，疏水基团则相互吸引、缔合在一起，向内形成球状体即为胶束，能显著提高其他成分在水中的溶解度。

3.2 油水分配系数测定

油水分配系数(logP)是指物质在正辛醇和水中分配系数比值的对数值，反映了物质在油水两相中的分配情况，logP值越小，说明该物质越亲水，水溶性越好，反之logP值越大越亲油。本实验以桃核承气汤为例，测定了除芒硝外单味药材、单味药材加甘草、桃仁+大黄+桂枝及桃仁+大黄+桂枝+甘草的油水分配系数，结果显示，无论是单味药材还是除甘草外的药材合煎液加甘草后油水分配系数均降低，说明加甘草后的药液水溶性成分增多，进而验证了甘草可以增加其他成分在水中的溶解度。

3.3 指标成分的确定及其溶解度

基于桃核承气汤方中组成药物的药理作用与此方的主要临床应用，可得出本方中主要指标成分有苦杏仁苷、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素、桂皮醛及甘草酸。其中大黄的指标成分为游离蒽醌，桂枝的指标成分为挥发油，此类成分极性较小，几乎不溶于水，故为验证甘草增溶的原理，本实验选取以上成分为指标成分，采用HPLC测定药材单煎液、药材与甘草合煎液、桃仁+大黄+桂枝及桃仁+大黄+桂枝+甘草中成分含量，并进行方法学研究，结果显示，加甘草后的合煎液中指标成分含量除甘草酸外均增加，从而验证了甘草酸能够增大其他成分在水中的溶解度。

4 结论

在临床应用的常用经方中，大部分方剂组成中含有甘草这味药。甘草在方剂的组成中多起着调和诸药、增强疗效的作用，其功兼佐使之用。而本文通过对桃核承气汤中基于油水分配系数与指标成分含量的甘草增溶作用研究，实验结果得出甘草具有增溶的作用，且主要通过甘草酸形成胶束来实现[14]。从而在理论上对甘草调和诸药、增强疗效的作用做出了相对科学的解释。因此，对于甘草增溶作用的研究对以桃核承气汤为代表的经典名方的临床应用更具现实与理论意义，可助其充分发挥其作为经典名方的临床治疗优势。为完善甘草增溶作用相关研究，后期研究将进一步探索甘草酸胶束的具体参数。