张妍妍，毕悦，尹丽颖，牛雯颖，肖洪彬

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

伸筋草为石松科植物石松LycopodiumjaponicumThunb.的干燥全草，在我国大部分地区均有分布，其味微苦、温、辛，归于肝、肾、脾经，具有祛风除湿、舒筋活络等功效[1]。伸筋草中含有丰富的生物碱类成分，还含有三萜类、黄酮类、挥发油等其他成分[2]，现代药理研究表明，其具有消炎、镇痛、抗菌、抑制乙酰胆碱酯酶活性、抗血小板凝集、调节免疫及抗氧化作用等多重药理作用[3-5]。多年来临床实践证实，伸筋草用于类风性关节炎、骨质增生性膝关节炎、创伤性关节炎等的治疗效果确切，然而关于伸筋草抗炎抗风湿的药物作用机制报道较少，且缺乏针对性的药效物质基础研究和毒理研究，影响了药物的进一步开发与应用。本研究旨在对伸筋草总生物碱成分的急性毒性及抗炎活性进行研究，为伸筋草药用资源的有效充分利用提供新的理论依据。

1 材料与仪器

1.1 试验药品

伸筋草药材由哈药集团世一堂中药饮片有限责任公司提供，并经黑龙江中医药大学实验实训中心中药形态实验室鉴定为石松科植物石松LycopodiumjaponicumThunb.的干燥全草。苦参碱对照品，购自于中国食品药品检定研究院，批号110805-201709。雷公藤多苷片，购自于远大医药黄石飞云制药有限公司，规格：10 mg/片，批号：20170301，用羧甲基纤维素钠配制成雷公藤多苷-CMC混悬液2.5 mg/mL。

1.2 试验动物

SPF级小鼠，体质量(20±2)g，实验动物许可证号：SYXK(黑)-2017-011， SPF级SD大鼠，体质量(200±20)g，实验动物许可证号：SCXK(吉)-2018-0007，均由黑龙江中医药大学GLP实验动物中心提供，在(25±2)℃下饲养，光照12 h/12 h明暗自动切换(7:00-19:00)，自由饮水采食，经检查判断为健康后用于试验。

1.3 仪器及试剂

001x7型强酸性阳离子交换树脂(河北森纳特化工有限公司)；Agilent 8453紫外-可见分光光度计(美国安捷伦科技有限公司)；IKA MVP 10基本型真空泵(艾卡广州仪器设备有限公司)；101-2A电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)。弗氏完全佐剂(批号：1002036152，西格玛公司)，水为双蒸水，其余试剂均为国产分析纯。

2 方法

2.1 伸筋草总生物碱的提取纯化与含量测定

2.1.1 伸筋草总生物碱的提取纯化

采用阳离子交换树脂法提取纯化伸筋草中的总生物碱成分[6]。取伸筋草药材500 g，烘干后粉碎成粗粉，加入0.2%的盐酸溶液渗漉提取，渗漉液经调pH值(pH=7.4)进行梯度沉淀，过滤，滤液上001×7阳离子交换树脂柱，流速3 BV/h，水洗至流出液中性，用5%的氨水洗脱树脂，洗脱液减压回收至膏状，烘干，即得伸筋草总生物碱提取物。

2.1.2 伸筋草总生物碱的含量测定

对照品溶液的制备：精密称取5 mg苦参碱对照品，置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1 mL含0.05 mg的苦参碱对照品溶液。

样品溶液的制备：精密称取10 mg伸筋草总生物碱干燥提取物，置于10 mL量瓶中，加甲醇超声溶解，并定容至刻度，即得。

样品中总生物碱含量的测定方法: 采用酸性染料比色法[7]，测定提取物中总生物碱的含量，精密量取样品溶液3 份，每份0.5 mL，分别置于分液漏斗中，依次分别加入pH 4.0的邻苯二甲酸氢钾缓冲液5 mL、三氯甲烷5 mL和溴甲酚绿溶液2 mL，振摇2 min，静置分层，取三氯甲烷层，在425 nm处测定吸光度。

2.1.3 线性范围考察

分别精密量取0.2、0.6、0.8、1.2、2.0 mL对照品溶液，置于分液漏斗中，同样品溶液的处理方法，依次加入pH 4.0的邻苯二甲酸氢钾缓冲液5 mL、三氯甲烷5 mL和溴甲酚绿溶液2 mL，振摇2 min，静置分层，取三氯甲烷层，在425 nm处测定吸光度。不加对照品，以空白溶剂同法处理为空白对照，所得三氯甲烷溶液，在425 nm处测定吸光度。以苦参碱对照品的质量浓度(X)为横坐标，吸光度(Y)为纵坐标，绘制标准曲线。

2.1.4 精密度试验

精密量取0.2 mL对照品溶液，同样品溶液的处理方法，所得三氯甲烷待测液，在425 nm处测定吸光度，连续测定5次，计算吸光度的RSD值。

2.1.5 重复性试验

精密量取样品溶液6份，每份0.5 mL，同样品溶液的处理方法，制得6份三氯甲烷待测液，在425 nm处测定吸光度，计算含量及RSD值。

2.1.6 稳定性试验

精密量取0.5 mL样品溶液，同样品溶液的处理方法，制得三氯甲烷待测液，室温放置0、2、4、6、8 h时，分别在425 nm处测定吸光度，计算不同放置时间的RSD值。

2.1.7 加样回收率试验

精密量取样品溶液5份，每份0.5 mL， 分别加入0.2 mL对照品溶液，同样品溶液的处理方法，制得三氯甲烷待测液，在425 nm处测定吸光度，计算加样回收率及RSD值。

2.2 伸筋草总生物碱的急性毒性试验

取SPF级小鼠60只，随机分为6个组，1组为正常对照组，其余5组为伸筋草总生物碱提取物不同剂量给药组，每组均为10只，雌雄各半。参考预试验结果，设置小鼠的5个给药剂量分别为1.38、2.07、2.76、3.45、4.14 g/kg(以总生物碱提取物量计)，给药体积均为25 mL/kg。依次取相应量的伸筋草总生物碱提取物溶于水，小鼠经口一次性灌胃，正常对照组小鼠灌胃等体积生理盐水，灌胃前12 h、灌胃后4 h均禁食，自由饮水，灌胃后连续观察14 d，记录小鼠的毒性反应和死亡情况，14 d后处死所有小鼠，肉眼观察心、肝、脾、胃、肾等主要脏器的变化，如发现病变情况则需要进行病理组织形态学检查。

2.3 伸筋草总生物碱的抗炎活性研究

2.3.1 弗氏完全佐剂致大鼠足跖肿胀试验

取SPF级SD大鼠60只，随机分为6个组，分别为正常对照组、模型组、雷公藤多苷阳性对照组(5.40 mg/kg)、伸筋草总生物碱提取物高剂量组(19.80 mg/kg)、伸筋草总生物碱提取物中剂量组(12.38 mg/kg)、伸筋草总生物碱提取物低剂量组(4.95 mg/kg)，每组均为10只，雌雄各半。正常对照组10只大鼠右后足跖皮下注射生理盐水0.15 mL，其余各组大鼠同法皮下注射等量弗氏完全佐剂，诱导佐剂型关节炎(Adjuvant-induced arthritis，AA)大鼠模型[8]。于造模后第10 d，以手术线环绕右后足跖部相应部位测量周长。测量后开始分组灌胃给药，每日1次，给药体积均为10 mL/kg，正常对照组和模型组同法给予等体积生理盐水，连续给药14 d。末次给药后2 h，同法再次测量右后足跖部周长，计算足跖肿胀改善率。足跖肿胀改善率(%)=(给药前大鼠右后足跖部周长-给药后大鼠右后足跖部周长)/ 给药前大鼠右后足跖部周长。

2.3.2 大鼠棉球肉芽肿增生试验

取SPF级SD大鼠50只，除去正常对照组，其余分组和给药剂量均同“2.3.1”项下方法。将各组大鼠以水合氯醛麻醉，在无菌条件下于腹股沟处植入一个50 mg的灭菌干棉球[9]，待大鼠当天清醒后开始灌胃给药，每日1次，模型组同法给予等体积生理盐水，连续给药14 d。末次给药后2 h，处死大鼠并取出棉球肉芽肿组织，置于60 ℃烘箱中，干燥24 h后取出称重，即为棉球肉芽肿质量。肉芽肿质量=棉球肉芽肿质量-原干棉球质量。

2.4 统计分析

应用SPSS 21.0软件包进行数据的处理统计，对符合正态分布的多组间均值比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齐性时采用LSD法，方差不齐时采用Dunnett'sT3法，数据结果均以均值±标准差(x±s)表示，P<0.05显示为差异具有统计学意义；急性毒性实验采用半数致死量(LD50)Bliss法进行数据处理。

3 结果

3.1 伸筋草总生物碱的提取纯化与含量测定结果

500 g伸筋草药材共提取纯化制得伸筋草总生物碱提取物92 g，提取率为18.4%。所得苦参碱的线性回归方程为：Y=396.68X+401.41(R2=0.999 2)，线性范围为1.9～14.3 μg/mL，表明苦参碱对照品与吸光度呈现良好的线性关系。精密度试验结果显示，苦参碱对照品连续测定5次吸光度的RSD值为0.86%，表明测定仪器的精密度良好。重复性试验结果显示，同法制得的5份样品待测液中的总生物碱含量分别为2.75、2.68、2.76、2.80、2.79 μg/mL，计算RSD值为1.71%，表明本试验所选的总生物碱样品处理方法与含量测定方法的重复性良好。稳定性试验结果显示，样品待测溶液在放置不同时间时测定的吸光度间的RSD值为0.92%，表明本试验方法制得的样品待测溶液在室温放置8 h内稳定。加样回收率试验结果显示，5份混合样品待测溶液的平均加样回收率为99.22%，RSD值为1.34%，表明本试验方法的加样回收率良好。伸筋草总生物碱的含量测定结果显示，所制得3份样品待测液中总生物碱的平均含量为2.77 μg/mL，见表1。以平均含量计算得伸筋草提取物中所含总生物碱的质量分数为30.47 μg/mg。

表1 伸筋草总生物碱的含量测定结果

3.2 伸筋草总生物碱的急性毒性试验结果

正常对照组小鼠均表现正常，未见死亡。试验小鼠在灌胃给药后多表现为食欲减弱，活动量减少，部分出现便溏现象，均在48 h内恢复正常。1～3 d内出现部分小鼠死亡，对死亡小鼠进行解剖，肉眼观察心、肝、脾、胃、肾等主要脏器，未见明显异常。3 d后未见继续死亡情况，连续观察14 d，存活情况良好，未出现其他毒性反应。14 d后，处死所有试验小鼠并解剖，肉眼观察心、肝、脾、胃、肾等主要脏器，未见明显异常。统计不同剂量给药组小鼠的死亡率，Bliss 法计算伸筋草总生物碱提取物的LD50为11.62 g/kg，见表2。

表2 伸筋草总生物碱的急性毒性试验结果

3.3 伸筋草总生物碱的抗炎活性研究结果

3.3.1 对弗氏完全佐剂致大鼠足跖肿胀的作用

实验结果见表3。

表3 伸筋草总生物碱对弗氏完全佐剂致大鼠足跖肿胀的作用

由表3可以看出，与正常对照组相比，模型组大鼠的足跖肿胀改善率显著升高(P<0.05)，可见弗氏完全佐剂诱导AA大鼠模型成功；与模型组相比，伸筋草高、中、低剂量组均能够改善AA大鼠模型的足跖肿胀情况，且呈现剂量依赖性，其中伸筋草高、中剂量组改善效果显著(P<0.05)。

3.3.2 对大鼠棉球肉芽肿增生的作用

实验结果见表4。

由表4可以看出，与模型组相比，伸筋草高、中、低剂量组均能够降低大鼠棉球肉芽肿的增生情况，且呈现剂量依赖性，其中伸筋草高、中剂量组降低效果显著(P<0.05)。

表4 伸筋草总生物碱对大鼠棉球肉芽肿增生的作用

4 讨论

伸筋草又名舒筋草，中医常用于治疗关节肿痛、风寒湿痹、筋脉拘急等症。研究报道，伸筋草具有较强的抗炎、抗风湿作用[10-11]，其抗炎活性物质可能为药材中富含的生物碱成分[12-13]，基于此，本研究对伸筋草药材中的生物碱成分进行了提取纯化和抗炎活性研究，以进一步验证伸筋草抗炎、抗风湿的药效物质基础，为临床伸筋草药物的应用和抗炎抗风湿药物的开发提供新的理论依据。

伸筋草中富含的生物碱成分主要为石松碱、石松定碱、石松灵碱等[2]。传统的生物碱提取方法多为碱性乙醇提取，三氯甲烷萃取，方法操作繁琐，且不适用于工业化生产[6]，阳离子交换树脂近年来常被用于生物碱的提取纯化，具有吸附容量大、装置简单、易再生的优点[14]，本研究采用强酸性阳离子交换树脂对伸筋草中的生物碱成分进行提取，提取溶剂选择极性较大的盐酸水(浓度0.2%)，待药物成分被阳离子交换树脂充分吸附后， 以碱性氨水洗脱，使生物碱成分在碱性环境下充分游离，大大提高了伸筋草总生物碱的得率[15]。由于伸筋草中的生物碱成分多无市售，故研究选择与伸筋草中生物碱结构相近的苦参碱做为对照品，对伸筋草提取物中的总生物碱含量进行了测定，得到质量分数为30.47 μg/mg的伸筋草提取物总生物碱成分。

本研究对伸筋草总生物碱提取物进行了急性毒性试验，结果显示，部分试验小鼠在给药后短期内表现为食欲减弱、活动量减少、便溏等轻微毒性反应， 48 h内即恢复正常。仅在1～3 d内出现少量动物死亡，3 d后未见新的动物死亡，连续观察14 d后，解剖可见心、肝、脾、胃、肾等主要脏器，未见明显异常，Bliss法计算伸筋草总生物碱提取物的LD50为11.62 g/kg，远超于正常人的服用剂量，可见，伸筋草总生物碱提取物的毒性较小，临床应用安全可靠。研究以弗氏完全佐剂致大鼠足跖肿胀试验和大鼠棉球肉芽肿增生试验，对伸筋草总生物碱的抗炎活性进行研究，结果显示，伸筋草高、中、低剂量组均能够改善佐剂型关节炎(AA)大鼠的足跖肿胀并降低大鼠棉球肉芽肿的增生情况，且呈现剂量依赖性，即给药剂量越大，抗炎效果越佳。其中伸筋草高、中剂量组与模型组相比，改善效果显著(P<0.05)。

综上可见，采用强酸性阳离子交换树脂提取纯化伸筋草中的生物碱成分，效果较佳，得到的伸筋草总生物碱提取物未见明显毒性，并具有较好的抗炎作用。