熊逸晨，吴瀚枫，张恩婷，苏宝玲，胡展恒

（1.广州中医药大学 深圳临床医学院,广东 深圳 518116；2.广州中医药大学第一临床医学院,广东 广州 511400）

急性痛风性关节炎（acute gouty arthritis, AGA）是体内嘌呤代谢异常所致的常见疾病，主要表现在血尿酸升高和尿酸钠（monosodium urate, MSU）晶体沉积两方面[1]。MSU 作为异物沉积在关节滑膜、软骨等处，白细胞因此聚集进入滑液，吞噬MSU，释放白细胞介素-1（Interleukin-1, IL-1）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α)等炎症因子，诱发炎症[2]。同时，AGA 还是一些心血管疾病、泌尿系统疾病的危险因素[3]。

现今西药治疗AGA 已经较为成熟，但临床容易出现严重的胃肠道反应、血细胞减少、肝肾功能不全、弥散性血管内凝血、中枢神经系统损害等不良反应[4]， 故近年来中药抗AGA 愈加得到学者们的重视。有研究表明，葛根素单独或配以其他药物，抗AGA 效果显著，然而临床治疗尚未普及，也未阐明其作用机制。现已明确AGA 的重要发病机制是由Toll 样受体4 （TLR4）-核转录因子-κB（NF-κB）信号通路介导，激活的Toll 样受体家族可诱导细胞产生TNF-α、IL-6、IL-1β 等促炎因子[5]，诱导炎症反应的发生与进展。因此，本研究将基于TLR4/NF-κB 通路探讨葛根素对AGA 的治疗作用，探讨葛根素抗AGA 的可能机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

MSU（上海源叶生物科技有限公司）混悬液：用无菌生理盐水配制成25 mg/ml 的MSU 混悬液，超声溶解10 min，4℃冰箱保存，用前摇匀；葛根素（成都德斯特生物技术有限公司）溶液：用无菌生理盐水配制成浓度为1 g/ml 葛根素溶液，超声溶解10 min，4℃冰箱保存；秋水仙碱（四川省维克奇生物科技有限公司）溶液：用无菌生理盐水配制成浓度为0.15 mg/ml 秋水仙碱溶液，超声溶解10 min，4℃冰箱保存；TLR4 抗体、NF-κB（p65）抗体（上海宝曼生物科技有限公司），IL-1β、TNF-α ELISA 试剂盒（广州妙博生物技术有限公司）。

1.2 实验动物与分组

选取成熟雄性SD 大鼠60 只作为研究对象，9 ～ 11 周龄，体重（200±15）g，由广州中医药大学新药开发与研究中心提供，许可证编号：SYXK（粤）2018-0085。实验环境温度控制在26℃左右，湿度稳定在65%左右，常规饲料喂养，自由进食进水。适应性喂养1 周后，随机分为4 组：正常空白对照组（正常组）、模型阴性对照组（模型组）、秋水仙碱阳性对照组（秋水仙碱组）、葛根素实验组（葛根素组），每组15 只。

1.3 动物模型复制

参照CODERRE 等[6]的方法复制模型，大鼠两侧后膝关节外侧膝眼进针，正常组向关节腔内注射0.2 ml无菌生理盐水，其余3 组注射等量25 mg/ml MSU 混悬液。肉眼观察大鼠膝关节出现红肿、僵硬，大鼠活动明显受限，即显示模型复制成功。

1.4 治疗药物干预方法

模型复制成功后48 h，葛根素组用1 g/ml 葛根素溶液灌胃，3.5 g/kg；秋水仙碱组用0.15 mg/ml 秋水仙碱溶液灌胃，1.5 mg/kg；正常组和模型组大鼠分别用等量生理盐水灌胃；各组大鼠都以20 ml/kg 为灌胃量，灌胃2 次/d，延续2 周。

1.5 检测指标及方法

1.5.1 AGA 大鼠膝关节肿胀程度除正常组外，缚线法量取每只大鼠模型复制前1h 及末次灌胃后4h 膝关节周径，在同一部位测量周径3 次，取平均值。

1.5.2 ELISA 法检测AGA 大鼠膝关节腔冲洗液IL-1β、TNF-α 含量除正常组外，分别在模型复制后48 h 和药物干预2 周后，在AGA 大鼠腹腔内注射10%水合氯醛麻醉，常规碘伏消毒，解剖大鼠单侧膝关节囊，用1 ml 无菌生理盐水洗涤关节腔，收集关节腔洗涤液。严格按照ELISA 试剂盒说明书操作，测定IL-1β、TNF-α 的含量。

1.5.3 膝关节滑膜组织病理学观察每组随机抽取3 只大鼠作为1 个样本，分离其膝关节滑膜组织，先由4%多聚甲醛固定，后置于4℃冰箱保存24 h，再用酒精和二甲苯梯度脱水，石蜡包埋、切片，厚度为4 μm，HE 染色，光学显微镜观察各组膝关节滑膜组织病理变化情况并对比各组间变化程度。

1.5.4 免疫组织化学法检测AGA 大鼠膝关节滑膜组织TLR4、NF-κB 表达量分别在模型复制48 h和药物干预2 周后，将上述切片脱蜡、水化、抗原完成热修复后降温至室温，再用PBS 冲洗5 min/次，反复冲洗2、3 次，滴加封闭液，在室温条件下孵育20 min。滴加一抗50 μl，4℃冰箱过夜，复温后PBS冲洗2、3 次，滴加HRP 标记的二抗40 ～50 μl，室温静置1 h，随后滴加SP，室温孵育1 h，DAB 显色5 ～10 min 后终止反应，经苏木精复染，常规脱水，透明、中性树胶封片，镜检，IPP 软件分析平均光密度（OD）值。

1.6 统计学方法

数据分析采用SPSS 25.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AGA 大鼠膝关节肿胀程度

复制模型后48 h，3 组AGA 大鼠关节肿胀度比较，经方差分析，差异无统计学意义（P＞0.05）。3 组AGA 大鼠关节肿胀度治疗药物干预前后差值比较，差异有统计学意义（P＜0.05），与模型组比较，秋水仙碱组、葛根素组大鼠膝关节肿胀程度均减轻，葛根素组大鼠关节肿胀程度又轻于秋水仙碱组（P＜0.05）。见表1。

2.2 AGA 大鼠关节腔冲洗液中IL-1β、TNF-α含量

复制模型后48h，模型组、秋水仙碱组、葛根素组大鼠IL-1β、TNF-α 组间比较，经方差分析，差异无统计学意义（P＞0.05）。药物干预2 周后，3 组大鼠IL-1β、TNF-α 差值比较，差异有统计学意义（P＜0.05），与模型组比较，秋水仙碱组和葛根素组IL-1β、TNF-α 含量降低，葛根素组IL-1β、TNF-α 低于秋水仙碱组（P＜0.05）。见表2。

2.3 各组大鼠关节滑膜组织光镜观察结果

正常组大鼠膝关节滑膜组织结构清晰，滑膜细胞排列整齐，细胞间为胶原性间质，无炎症细胞浸润，无毛细血管增生、充血、水肿（见图1A）；与正常组比较，模型组大鼠滑膜组织结构清晰程度下降，伴明显水肿，滑膜细胞排列紊乱且有大量炎症细胞浸润，正常胶原性间质明显减少，且伴毛细血管增生（见图1B）；与模型组比较，秋水仙碱组及葛根素组滑膜炎症反应均有不同程度减轻，其中葛根素组病变减轻程度较秋水仙碱组更明显（见图1C、D）。

表1 3 组AGA 大鼠治疗药物干预前后膝关节肿胀度比较 （n =15，mm，±s）

表1 3 组AGA 大鼠治疗药物干预前后膝关节肿胀度比较 （n =15，mm，±s）

注：①与模型组比较，P ＜0.05；②与秋水仙碱组比较，P ＜ 0.05。

组别 复制模型后48 h 末次灌胃后4 h 差值模型组 28.23±2.31 25.12±5.07 -3.10±4.49秋水仙碱组 27.45±1.74 22.99±1.67① -4.46±2.37①葛根素组 28.23±1.20 20.97±1.90①② -7.25±2.09①②F 值 0.930 6.040 6.241 P 值 0.404 0.005 0.004

表2 3 组AGA 大鼠关节腔冲洗液中IL-1β、TNF-α 含量比较 （n =15，ng/L，±s）

表2 3 组AGA 大鼠关节腔冲洗液中IL-1β、TNF-α 含量比较 （n =15，ng/L，±s）

注：①与模型组比较，P ＜0.05；②与秋水仙碱组比较，P ＜0.05。

组别IL-1β TNF-α复制模型后 48 h 药物干预2 周后 差值 复制模型后 48 h 药物干预2 周后 差值模型组 104.87±7.07 116.28±2.72 11.40±6.59 205.32±5.95 220.31±5.23 14.99±7.23秋水仙碱组 102.22±3.61 62.71±5.54① -39.50±7.26① 202.51±4.38 90.68±10.54① -111.83±11.75①葛根素组 102.61±2.88 54.83±4.10①② -47.78±5.92①② 201.91±3.67 73.30±7.36①② -128.61±7.82①②F 值 1.295 854.683 328.476 2.052 1 492.986 1 029.108 P 值 0.285 0.000 0.000 0.141 0.000 0.000

图1 各组大鼠膝关节滑膜组织病理结果（HE 染色×400）

2.4 AGA 大鼠膝关节滑膜组织中TLR4、NF-κB表达量比较

复制模型后48h，模型组、秋水仙碱组、葛根素组大鼠TLR4、NF-κB 表达量比较，经方差分析，差异无统计学意义（P＞0.05）。药物干预2 周后，3 组间差值比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，秋水仙碱组和葛根素组TLR4、NF-κB 表达量降低，葛根素组TLR4、NF-κB 表达量又低于秋水仙碱组（P＜0.05）。见表3。

表3 3 组AGA 大鼠关节滑膜组织中TLR4、NF-κB 表达量比较 （n =15，±s）

表3 3 组AGA 大鼠关节滑膜组织中TLR4、NF-κB 表达量比较 （n =15，±s）

注：①与模型组比较，P ＜0.05；②与秋水仙碱组比较，P ＜0.05。

组别TLR4 NF-κB复制模型后 48 h 药物干预2 周后 差值 复制模型后 48 h 药物干预2 周后 差值模型组 0.33±0.16 0.35±0.02 0.02±0.02 0.35±0.02 0.31±0.03 -0.04±0.03秋水仙碱组 0.33±0.02 0.21±0.02① -0.11±0.03① 0.35±0.01 0.21±0.06① -0.13±0.05①葛根素组 0.33±0.02 0.17±0.01①② -0.16±0.02① 0.35±0.01 0.14±0.02①② -0.20±0.03①②F 值 0.367 366.507 220.680 0.110 68.214 68.843 P 值 0.695 0.000 0.000 0.896 0.000 0.000

3 讨论

中医对痛风早已有了认识，称其痹症、白虎历节。《金匮要略·中风历节病脉并治》就为该病讲述一系列临床表现诸肢节疼痛，身体魁羸，脚肿如脱，头眩短气，温温欲吐。《外台秘要·卷十三·白虎方》阐述到其疾昼静而夜发，发即彻髓，酸疼乍歇，其病如白虎之啮，故名曰白虎之病也。《诸病源候论》亦对痹证进行陈述，同时点出风寒湿三气侵袭入体进而转变为短气、自汗出、四肢疼痛、不得屈伸等乃痹证之主要病因[7]。

《神农本草经》中描述葛根，主消渴、身大热、呕吐、诸痹、起阴气、解诸毒。其有用组成是葛根素，葛根素系异黄酮类化合物，其资源丰富，药理作用广泛，安全、有效，适应范围广[8]。葛根素可调节白细胞介素系统（ILs）中促炎因子与抗炎因子的含量；抑制促炎因子如TNF-α 对中性粒细胞的趋化作用，减少炎症介质的释放；或阻止NF-κB 参与细胞的免疫调节和炎症反应[9-10]。

此外，葛根素对黄嘌呤氧化酶存在抑制效果，从而降低尿酸水平[11]。葛根素尚能促进组织向血液中释放一氧化氮NO，降低炎症组织中NO 含量[12]。还有研究发现，葛根素能够有效地通过促进近曲小管上皮细胞内三磷酸腺苷结合盒转运体G2基因的表达，促进肾脏对尿酸的分泌，具有治疗AGA 的作用[13]。现有文献报道中，单纯大剂量使用葛根素和与其他中药配伍结合治疗AGA，葛根素在一定程度上的确能起到缓解患者关节的肿胀疼痛的作用，且让患者体内尿酸浓度下降[14-15]。

TLR4/NF-κB 通路是现在研究AGA 发病机制的热点。TLRs 为I 型跨膜受体，当其活化后通过Toll/IL-1 受体结构域（TIR）与髓样分化分子88（MyD88）结合，并激活IL-1 受体相关激酶（IRAK）[16-18]；随后结合TNF 受体相关因子6（TRAF6）活化转化生长因子β 活化激酶1（TAK1），进而激活NF-κB，NF-κB 是一种参与调控多种基因表达的核转录因子，其活化后可以控制转录IL-1β 前体，最后再在一些炎症体的作用下，大量IL-1β、TNF-α 等细胞因子被释放[19]。在AGA 的发病过程中，关节液尿酸浓度过饱和，沉积形成MSU，MSU 可作为损伤相关模式分子（DAMP），直接或通过破坏细胞产生组织蛋白酶等，触发机体非特异性免疫反应，激活炎症体，趋化中性粒细胞，产生瀑布效应，大量炎症因子聚集在关节及其周围组织处，诱发急性炎症反应，其中TLR4 作为模式识别受体发挥关键作用[20-22]。

本研究结果显示，与模型组比较，秋水仙碱组、葛根素组滑膜组织的炎症程度均可见明显减轻，ELISA 结果表明关节腔冲洗液中IL-1β、TNF-α 含量降低，免疫组织化学结果表明关节滑膜组织中TLR4、NF-κB蛋白表达量下调。与秋水仙碱组比较，葛根素组大鼠治疗后膝关节肿胀度、关节滑膜组织炎症改变明显，关节腔冲洗液中IL-1β、TNF-α 含量、滑膜组织中TLR4、NF-κB 蛋白表达量均低于秋水仙碱组。

综上所述，葛根素治疗AGA 有效，其可能的作用机制为通过阻断TLR4/NF-κB 通路，抑制IL-1β、TNF-α 的产生，达到抗炎、镇痛、改善临床症状的作用。本研究的应用价值和现实意义在于基于TLR4/NF-κB 通路探讨葛根素治疗AGA 的作用，同时对比葛根素与秋水仙碱治疗AGA 的疗效优劣，进一步阐明葛根素治疗AGA 的机制，为葛根素防治AGA 提供客观的临床前实验数据和理论依据，为具有相似功能的其他药物的作用机制探讨提供思路与方法。