李彦琦，左卓，高天畅，王贞缔，侯永永

（1.中国医科大学附属第四医院 第一肿瘤内科，辽宁 沈阳 110032；2 中国医科大学公共卫生学院，辽宁 沈阳 110122）

脂代谢是指脂质，如甘油三脂、胆固醇和磷脂等在体内消化、吸收、转运、合成、储存和分解等生理过程。脂质代谢紊乱与多种疾病的发生、发展密切相关，如糖尿病、动脉粥样硬化和肿瘤等[1-3]。脂肪的合成与分解是调控能量代谢的核心机制之一。当机体处于能量过剩状态时，脂肪合成增多；当机体处于饥饿或交感神经兴奋时，肾上腺素、去甲肾上腺素和胰高血糖素等分泌增加，促进脂肪动员。脂肪动员需要多种酶和蛋白参与，如围脂滴蛋白1（Perilipin-1）、脂肪甘油三酯脂肪酶（adipose triglyceride lipase, ATGL）、激素敏感性脂肪酶（hormone sensitive lipase, HSL）和甘油一酯脂肪酶（monoglyceride lipase, MGL）等[4-5]。HSL 除在胰腺和睾丸等组织中表达外，主要由脂肪细胞生成，其催化甘油二酯生成甘油一酯和脂肪酸，是脂肪分解的关键酶之一[4-6]。

HSL 的活化与转录调控是研究脂肪分解的关键，早期的报道显示过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ）能与HSL 基因启动子区域结合调控HSL 的转录，是已确认的转录调控因子[7]。考虑HSL 在脂肪分解过程中的关键调控作用，寻找能够调控HSL 转录调控的临床药物、小分子化合物、上游转录调控因子和环境应激物等，将有助于探索脂代谢相关疾病的机制及治疗研究。本研究拟构建HSL 报告基因系统，并在293T 细胞中验证能否被已知上游转录调控因子PPARγ 激活。

1 材料与方法

1.1 材料

Universal Genomic DNA 提取试剂盒与Enzymatic Lysis Buffer 购自北京康为世纪生物科技有限公司，LA Taq DNA 聚合酶、Taq Mix、感受态细菌TRANS5α、琼脂糖、EasyPure HiPure Plasmid Mini Prep Kit 试剂盒、EasyPure Quick Gel Extraction Kit 试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，KpnI、EcorV 限制性内切酶、T4 连接酶和DL 2000 DNA Marker 购自日本TaKaRa 公司，PCR 引物和LB Broth 购自生工生物工程（上海）股份有限公司，Luciferin 和荧光素酶报告基因pGL4.10-basic 购自美国Promega 公司，293T 细胞购自美国ATCC 公司，Lipofectamine 3000 试剂购自美国Invitrogen 公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠基因组DNA 提取野生型C57BL/6 小鼠来自中国医科大学实验动物部。分离野生型C57BL/6小鼠棕色脂肪组织，后称取10 mg，按基因组DNA 快速提取试剂盒（Universal Genomic DNA kit）说明书步骤提取小鼠基因组DNA。应用Nanodrop 核酸分析仪和1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 浓度及DNA 纯度与完整性。基因组DNA 用于PCR 复制模板或置于-80℃冰箱冷冻保存备用。

1.2.2 引物设计与合成以小鼠HSL基因（NC_000073.6）及正向序列为目标序列，应用Primer Blast 在线服务程序设计引物：P1（含Kpn I 位点）正向5'-TGACGCGGTACCTCAGACTCATGGACGGGCAG GCAT-3'；P2（含Kpn I 位点）正向5'-TGACGCGGTA CCGCCACCCTCTCCCTTCATCAA-3'；共用P3（含Ecor V 位点）反向5'-GCTCTAGATATCTGGCACAGCAGG TCTGTGGCTAGT-3'；扩增片段产物长度为3 086（P1与P3）和1 046 bp（P2 与P3）。上述引物由美国Life Technology 公司合成。

1.2.3 目的片段扩增以小鼠基因组DNA 为模板，应用P1 和P3 引物，扩增HSL基因启动子（-3 071 ～+ 15 bp）DNA 序列；应用P2 和P3 引物，扩增HSL基因启动子（-1 031 ～+15 bp）DNA 序列。反应体系：45 μlMix+1 μl primer（10 μmol/L）+4 μl DNA（300 ng）；反应条件：94℃预变性120 s；94℃变性30 s；65℃退火30 s；68℃延伸1 min；循环25 次；68℃维持10 min。取10 μl PCR 产物用于1%琼脂糖凝胶电泳（电压100 V），紫外灯下观察产物片段位置。从琼脂糖凝胶中切出长度正确的PCR产物片段，回收、纯化和保存PCR 产物。

1.2.4HSL基因启动子报告质粒的构建及鉴定应用限制性内切酶KpnI 和EcorV 分别酶切PCR 扩增产物和空载体pGL4.10-basic 质粒，琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，回收和纯化目的DNA 片段。应用T4 DNA 连接酶连接带有黏性末端的线性pGL4.10-basic DNA 和HSL基因启动子片段，37℃孵育1 h，将反应产物转化至TRANS5α 感受态细菌中，于含氨苄霉素的LB 培养皿中筛选。16 h 后取单个阳性克隆菌落扩增，用于酶切和测序验证。测序由苏州金唯智生物科技有限公司完成。命名重组载体为pGL4.10-basic-HSL。

1.2.5 pGL4.10-basic-HSL 转录活性检测将293T细胞接种于96 孔板内，在37℃、5%二氧化碳CO2条件下增殖至60%～80%时，应用Lipofectamine 3000试剂盒DNA 转染，48 h 后按照荧光素酶检测系统方法处理转染细胞，并通过Sunergy H1/H1 MD 系统测定荧光值。实验组每孔转染40 ng pGL4.10-basic-HSL 和120 ng PPARγ 质粒，对照组每孔转染40 ng pGL4.10-basic-HSL 和120 ng Empty Vector 质粒。实验组、对照组各6 孔平行样，并重复3 次。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 11.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用t检验，P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HSL 基因启动子报告质粒构建成功

实验得到pGL4.10-basic-HSL-3K 和pGL4.10-basic-HSL-1K 质粒。双酶切两质粒，结果显示插入片断长度正确（见图1A，4 和9 泳道；图1B，7 和9 泳道）。进一步测序结果显示，克隆的小鼠HSL 基因启动子序列与GenBank 数据库中信息完全一致，提示重组载体pGL4.10-basic-HSL 插入片断序列正确。

2.2 pGL4.10-basic-HSL 具有启动子活性

与共转染pGL4.10-basic-HSL 和Empty Vector比较，重组载体pGL4.10-basic-HSL（3 和1 K）和PPARγ共转染293T细胞后，pGL4.10-basic-HSL 荧光素酶活性升高[-3 071 bp 为（24.71±2.80）倍，t=20.700，P=0.000；-1 031 bp 为（4.12±0.23）倍，t= 32.100，P=0.000]，提示构建的pGL4.10-basic-HSL 具有启动子活性（见图2）。

图1 双酶切两质粒结果

图2 质粒萤光素酶活性比较

3 讨论

脂肪依据分布、形态与功能，可分为白色脂肪、棕色脂肪以及米色脂肪。白色脂肪细胞内含单个大脂滴，多分布于皮下和脏器周围，是机体的主要储能场所；棕色脂肪细胞内含多个小脂滴，以消耗ATP 产热为主要功能，多见于婴幼儿，随年龄增长不断减少[8-11]。米色脂肪细胞的形态与功能介于白色与棕色脂肪细胞之间，常见于冷暴露后的脂肪组织中[8-11]。

白色脂肪是甘油三脂储存和代谢的主要组织。脂肪分解是维持机体能量代谢稳态的核心机制之一。HSL 作为甘油三酯分解的关键酶，在脂质代谢过程中起到关键的调控作用。报道显示，HSL 的缺失可造成严重的脂质代谢紊乱[12-14]，因而HSL 的转录调控研究受到广泛的关注。

HSL基因启动子区域含有多种转录因子的结合位点。应用生物信息学分析技术，可以发现HSL基因上游启动子区域含有多个潜在的转录因子结合位点，有待未来验证。PPARγ 是已被确认的能与HSL基因启动子区域结合的转录因子[7]。研究中也证实这一结论：当启动子区域未能覆盖PPARγ 结合位点时（启动子插入片段长度为1 kb），PPARγ 的激动效应降低。

翻译后修饰激活HSL。在脂解激素的作用下，细胞内第二信使cAMP 水平迅速升高，继而激活cAMP依赖的蛋白激酶A，后者磷酸化和活化HSL，最终参与脂解过程[5]。因此，HSL 的脂解功能取决于其转录调控与磷酸化水平，可能还涉及其他的翻译后修饰类型或降解水平等。因而，应该结合多方面因素，综合分析HSL 的脂解功能调控。

综上所述，本研究成功构建HSL基因启动子报告质粒，为筛选诱导HSL转录表达的临床用药、小分子化合物、正向反式作用因子及环境应激物提供基础而高效的研究工具，将有助于深入研究HSL 的转录调控在代谢性疾病中的作用及潜在机制。