房子倩，龚永媚，徐昊，黄健华，黄克强

（1.锦州医科大学附属第二医院 正畸科，辽宁 锦州 121004；2.锦州医科大学附属第一医院 外科学重点实验室，辽宁 锦州 121000）

舌癌是口腔癌中常见的恶性肿瘤之一，在我国，舌癌发病率居口腔癌第1 位[1]。舌癌生长快、浸润性强、恶性程度较高，常波及舌肌致舌运动受限以及语言障碍、吞咽困难，并易通过血液、淋巴循环通路至全身转移，预后差[2]。目前手术为主的综合治疗是其主要治疗方式，由于位置较为特殊，手术切除范围受限，且易破坏患者容貌，给患者身心带来极大伤害。近年来舌癌发病率呈上升趋势且不断年轻化[3]，因此，研究新型有效药物对于舌癌的治疗有重要意义。

熊果酸是一种存在于天然植物中的三萜类化合物，广泛存在于蔬菜和中药中。已证明熊果酸具有抗炎、降温、保护肝损伤等作用[4-5]。近年来研究发现，熊果酸有抗癌及抗血管生成等作用[6-8]。目前国内外关于熊果酸对舌癌影响及机制的详细研究相对较少，本实验以人舌癌细胞Tca8113 为研究对象，探究熊果酸对其生长、迁移和凋亡的影响及其机制。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

熊果酸（药物浓度≥98%，南京景竹生物公司）， 分子式：C30H48O3，分子量为456.68，CAS 号：77-52-1。 人舌鳞癌细胞株Tca8113（美国ATCC 公司），胎牛血清、RPMI1640 培养基（美国Gibco 公司），MTT（Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide）试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒、Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒（武汉碧云天生物公司），兔抗人局部黏着斑激酶（focal adhesion kinase, Fak）、磷酸化局部黏着斑激酶（phosphorylated focal adhesion kinase, p-Fak）、B细胞淋巴瘤-2（B cell Lymphoma 2, Bcl-2）、Bcl-2- Associated X 的 蛋 白 质（Bcl-2-associated X protein,Bax）、活化冬氨酸蛋白水解酶-3（cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3, Cleaved-caspase 3）抗体、 辣根过氧化酶标记山羊抗兔IgG 抗体（沈阳万类生物公司），流式细胞仪、电泳仪（美国BD 公司），自动 凝胶成像仪、凝胶成像分析系统、酶标仪（美国Thermo Fisher 公司），倒置显微镜（德国LEICA 公司）。

1.2 方法

将含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基（含青霉素100 u/ml、链霉素100 mg/L）置于37℃、5%二氧化碳恒温箱内培养人舌癌Tca8113 细胞。待细胞处于对数生长期时，用0.25% EDTA 胰蛋白酶消化和传代，进行以下实验。

1.2.1 MTT 法测试熊果酸对Tca8113 细胞活性的影响取对数生长期Tca8113 细胞消化后离心收集，重悬后稀释浓度为5×104个/ml 接种于96 孔板中，每孔加200 恒温箱培养24 h 后，加入不同浓度梯度（0、20、40、50、80 及100 μmol/L）熊果酸的培养基于预设6 组复孔中，24 h 后每孔中加20 μl MTT 染色液孵育4 h，吸出上清液后加150 μl DMSO，震荡10 min，用酶标仪（波长490 nm）测各孔光密度（OD）值，计算各浓度细胞生长抑制率。计算方法：细胞生长抑制率（%）=（1-实验组A 值/对照组A 值）× 100%。

1.2.2 克隆形成实验取对数生长期Tca8113 细胞消化后离心收集，重悬接种于6 孔板内，500 个/孔。待细胞贴壁后加入80 μmol//L 含熊果酸培养液并设置阴性对照组。培养箱内培养7 d 后吸弃培养液，磷酸盐缓冲溶液（PBS）洗涤2 次后加结晶紫染色10 min，PBS 再次清洗，拍照记录实验结果。

1.2.3 划痕实验检测熊果酸对舌癌细胞Tca8113 迁移的影响将密度为4×105个/ml 的Tca8113 细胞每孔2 ml 接种于6 孔板中，置恒温箱培养24 h，细胞生长融合达90%左右时用200 μl 移液器枪头均匀划痕，用PBS 洗涤去除漂浮细胞，加入含熊果酸（8 μmol/L） 培养液并设空白对照组。分别于0、12 及24 h 后观察对照组与实验组划痕迁移情况，用Image J 图像处理软件分别测量0、12 及24 h 的划痕间距并计算其迁移率。

1.2.4 Hoechst33342 染色观察舌癌细胞Tca8113 的凋亡Tca8113 细胞处于对数生长期时，消化收集后制成细胞悬液接种于12 孔板内，每孔1×105个细胞，待细胞融合90%左右，加药分别培养0、12 及24 h 后，加入5 μg/ml Hoechst33342 工作液于37℃恒温孵箱染色15 min，用荧光照相显微镜拍照记录。

1.2.5 流式细胞术检测Tca8113 细胞的凋亡取对数生长期Tca8113 细胞消化后离心收集，按5×105个细胞接种于4 个培养皿中，设置空白对照组及实验组（熊果酸80 μmol/L），孵箱内培养24 h 后观察。加药培养后分别于12 和24 h 消化离心，PBS 清洗2 次后加入150 μl PBS 重悬细胞。向细胞悬液内加入5 μl AV（annexin V-FITC），4℃避光下孵育15 min 后加入10 μl 碘化丙锭（PI），混匀后孵育5 min，上机进行流式细胞仪检测。

1.2.6 Western blotting 检测相关蛋白表达取处于对数生长期Tca8113 细胞消化重悬后制成密度为5× 105个/ml 的单细胞悬液接种于培养皿中，待融合至80%时进行加药实验。设置空白对照组及实验组；收集Tca8113 细胞并于0、1、3、6、12 及24 h 后分别取出相应培养皿，待细胞在冰上裂解后提取细胞蛋白并检测蛋白浓度后制样。上样后进行电泳，用聚偏二氟乙烯膜转膜，封闭1.5 h 后，分别加一抗p-Fak、Fak、Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3，4℃孵育过夜，洗膜后加入辣根过氧化酶标记的二抗，经室温孵育2 h 后洗涤，加高敏荧光显影液曝光显影。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 17.0 软件，计量资料以均数± 标准差（±s）表示，比较采用t检验或单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t法，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 熊果酸对Tca8113 细胞活性的影响

MTT 实验结果显示，使用不同浓度（0、20、40、 50、80 及100 μmol/L）熊果酸处理Tca8113 细胞，细胞 增殖抑制率分别为（0.00±0.00）%、（7.41±0.56）%、（22.19±1.64）%、（41.58±1.10）%、（51.11±2.00）%和（71.08±2.71）%，差异有统计学意义（F=16.595，P=0.000），随药物浓度增加，细胞增殖抑制率上升（见图1）。熊果酸浓度设为0 μmol/L 组、40 μmol/L 组和80 μmol/L 组，其克隆形成率分别为（73.0±3.6）%、（13.6±2.8）%和（0.0±0.0）%，经方差分析，差异有统 计学意义（F=36.442，P=0.000）；与0 μmol/L 组比较，40 μmol/L 组和80 μmol/L 组克隆形成率降低（P＜ 0.05），80 μmol/L 组未见明显克隆株，处于静止期（见图2）。

图1 不同浓度熊果酸处理24 h 对Tca8113 细胞活性的影响（±s）

图2 不同浓度熊果酸对细胞克隆形成的影响（±s）

2.2 熊果酸对人舌癌Tca8113 细胞凋亡的影响

0 h 组细胞细胞核弥散均匀蓝光，颜色较为浅淡，形态规则，无固缩、碎裂；12 h 组出现多数细胞核高亮度荧光染色，不同程度固缩、碎裂；24 h 组大部分细胞细胞核呈高亮荧光染色，核固缩、碎裂的细胞更多（见图3）。

给 药0、12 和24 h 后凋 亡率分别 为（0.73± 0.12）%、（21.91±1.30）% 和（44.36±2.04）%，经方差分析，差异有统计学意义（F=736.006，P= 0.000）；与0 h 组比较，12 h 和24 h 组凋亡率升高（P＜ 0.05），且随时间的增加凋亡率随之升高（见图4）。

2.3 熊果酸对舌癌细胞Tca8113 迁移的影响

12 和24 h 后空白对照组发生迁移（见图5、6 和表1），实验组的划痕比空白对照组宽，迁移率随时间的延长而提高，镜下观察可见细胞的体积减小、形态皱缩等变化，划痕后细胞愈合能力降低并随时间的延长而降低。12 h 实验组与空白对照组比较，差异有统计学意义（t=3.911，P=0.041）；24 h 实验组与空白对照组比较，差异有统计学意义（t=11.539，P=0.001）；24 h 实验组与12 h 实验组比较，差异有统计学意义（t= -13.735，P=0.000）。

2.4 Tca8113 细胞的相关蛋白表达

各相关蛋白相对表达水平在不同时间点的比较，差异有统计学意义（P＜0.05），p-Fak、Fak、Bcl-2 的蛋白 表达水平随时间延长而降低，而Bax、Cleaved Caspase-3的蛋白表达水平随时间延长而升高。见图7 和表2。

图3 各组细胞的形态学改变（Hoechst33342 染色）

图4 熊果酸对Tca8113 细胞凋亡的影响

图5 两组不同时间点的划痕比较

图6 熊果酸对Tca8113 细胞迁移能力的影响（±s）

表1 熊果酸对Tca8113 细胞迁移率的影响 （n =3，%，±s）

表1 熊果酸对Tca8113 细胞迁移率的影响 （n =3，%，±s）

注：①与空白对照组比较，P ＜0.05；②与12 h 实验组比较，P ＜ 0.05。

组别 12 h 24 h空白对照组 14.29±3.50 64.23±6.70实验组 7.14±2.60① 47.83±5.10①②

图7 熊果酸对Tca8113 细胞相关蛋白表达量的影响

表2 各时间点不同蛋白相对表达水平比较 （±s）

表2 各时间点不同蛋白相对表达水平比较 （±s）

组别 Bcl-2 Bax Cleaved Caspase-3 p-Fak Fak 0 h 1.302±0.045 0.242±0.013 0.131±0.003 0.738±0.039 0.775±0.064 1 h 1.063±0.059 0.323±0.009 0.209±0.009 0.583±0.019 0.709±0.044 3 h 0.836±0.036 0.468±0.010 0.292±0.008 0.528±0.020 0.623±0.026 6 h 0.724±0.031 0.552±0.020 0.357±0.012 0.508±0.020 0.571±0.027 12 h 0.615±0.041 0.747±0.038 0.462±0.019 0.273±0.016 0.186±0.009 24 h 0.576±0.033 0.931±0.049 0.529±0.032 0.163±0.008 0.113±0.008 F 值 131.910 255.415 236.973 259.171 180.578 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

3 讨论

熊果酸又名乌苏酸，以与糖结合成苷或者游离的形式分布于多种植物中，有抗菌、降血糖等多种生物活性[9]。近年来研究发现熊果酸有抗肿瘤作用，通过对肿瘤细胞活性、凋亡、血管生成、迁移等多种生物学功能进行调控[10]，发挥抑制肿瘤细胞发生、发展的作用[11]。本实验发现其对舌癌Tca8113 细胞有抑制作用且呈浓度依赖性，提示熊果酸有抗肿瘤作用，与相关实验研究结果[12-15]一致。在前列腺癌研究中，熊果酸通过ROCK/PTEN 介导Cofilin-1 线粒体定位，从而诱导前列腺癌细胞的凋亡[16]。本实验结果表明，熊果酸对Tca8113 细胞具有促凋亡作用，且呈时间依赖性。细胞凋亡是由基因主导的细胞自发有序死亡过程，大致分为内源性途径和外源性途径2 种，其中内源性凋亡的核心环节是线粒体途径，其过程包括抗凋亡因子Bcl-2 表达量减少，促凋亡因子Bax 的表达量增加并转位线粒体，进一步调节Cyt C，使Cyt C 释放入胞浆，激活Caspase-9 进而召集激活Caspase-3，引起Caspase 级联反应，下游底物剪切被激活从而发生细胞凋亡[17]，其中Bcl-2 和Bax 的比值对内源性凋亡有重大影响。本实验结果表明，Tca8113 细胞经熊果酸作用后Bax 表达量增强，而Bcl-2 表达量减弱，Bcl-2/Bax 比值降低，且Cleaved caspase-3 表达增强，提示熊果酸可诱导Tca8113 细胞的凋亡。可推测熊果酸能促进Bax 等促凋亡基因表达而抑制Bcl-2 等抑凋亡基因表达，进而激活Caspase-3 引发其级联反应，导致细胞凋亡。GAYATHRI 等[18]发现熊果酸能通过线粒体凋亡的途径诱导白血病细胞K562 凋亡，与本研究结果相符。

肿瘤细胞的迁移与细胞外基质黏附作用有关， Fak 是一种蛋白酪氨酸激酶，可调节各种类型细胞的黏附、运动、迁移和存活。Fak 在晚期癌症中可通过与整合素、G 蛋白偶联受体和细胞因子受体的相互作用而被激活，并促进癌症进展和转移[19]。在胶质瘤研究中发现通过抑制Fak 表达，可抑制其迁移能力[20]。研究表明[21]，抑制乳腺癌细胞的Fak 后，其细胞迁移减少，降低了乳腺癌发生，并认为Fak 是通过维持肿瘤干细胞的量来促进癌症的发生。Fak 激酶依赖性功能通常与局灶性黏连的整合素相关信号传导相关，在正常细胞和癌细胞中的细胞迁移和黏附中起重要作用，其结构位于Fak 的中间并含有活化环，酪氨酸（Y）位点Y576 和Y577，它们可被Src 磷酸化，可以抑制肿瘤生长和转移[22]。活化的Fak 作为肿瘤进展和转移的关键信号介质起着重要作用，表明Fak 是癌症治疗的潜在靶点[23]。本研究划痕实验结果表明，一定浓度熊果酸可对Tca8113 迁移起到抑制作用，同时经熊果酸处理后p-Fak、Fak 表达下调，说明熊果酸可抑制Tca8113 细胞的迁移，这一结论与其在其他肿瘤中的现象一致[24-25]。

综上所述，熊果酸作为一种天然植物中的三萜类化合物，能抑制舌癌Tca8113 细胞的体外活性，下调p-Fak、Fak 抑制其迁移，并通过促进Bax 表达、抑制Bcl-2 表达，诱导其凋亡。