王婷，黄永汉，杨画，黄娟华，徐杰伟，张清学

（1.中山大学孙逸仙纪念医院 生殖医学中心 广东 广州 510030；2.佛山市第一人民医院 生殖医学中心 广东 佛山 528000；3.佛山科学技术学院医药工程学院 广东 佛山528225）

隐睾是最常见的男性生殖系统先天畸形之一，又称睾丸下降不全。隐睾周围温度比阴囊内高2～3℃，会导致生精细胞过度凋亡，从而影响生育。隐睾在足月男婴中发病率达3%～4%[1]，随着环境污染加剧，食物中各种性激素的滥用，隐睾发病率逐年上升[2]。研究显示，隐睾是男性不育的重要原因之一[3]。在睾丸下降过程中，任何环节出现问题都可能导致隐睾，具体机制尚不清楚，目前有内分泌学说、解剖学说、雄激素受体、遗传因素及环境中的危险因素等多种解释[4]。有文献报道，氟他胺（Flutamide,Flu）能影响睾丸发育，抑制睾丸下降，其机制可能与阻断胚胎期雄性激素有关[3-5]。本研究采用Flu诱导SD大鼠，复制隐睾模型，探讨视黄酸对隐睾生精细胞增殖分化及减数分裂的作用及其机制，为男性不育奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选择210～230 g SPF级SD大鼠60只，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，动物许可证号：SCXK（京）2014-0004，单位许可证号：SYXK（翼）2014-0062。大鼠在佛山科学技术学院动物实验中心饲养，饲养室温度控制在22～25℃，相对湿度60%～70%，室内每天通风换气1、2次。大鼠适应性喂养7 d后，将雌雄大鼠按1∶1 合笼，每日观察雌鼠的阴栓。对阴栓脱落雌鼠分笼喂养并标记为妊娠0 d（30只SD孕鼠均怀孕）。所有操作均按照3R 原则给予人道关怀。

1.2 实验分组

将30只SD孕鼠随机分为对照组、模型组、干预组，每组10只。模型组大鼠孕12～20 d 皮下注射Flu 25 mg/（kg·d）（玉米油配制）。干预组在模型组基础上，其子代雄鼠出生后第1～10 天及第28～30 天皮下注射视黄酸1 mg/（kg·d）（玉米油配制）。对照组常规饲养不给任何药物或试剂。每组取10只子代雄鼠进行研究。

1.3 主要试剂与仪器

Stra8、Scp3、c-Kit、PLZF 兔多克隆抗体（美国BD公司，批号分别为orb131626、562530、555714和3032695），BCA试剂盒（北京诺博莱德科技有限公司，批号：P1511），DAB显色试剂盒（福州中杉金桥生物技术有限公司，批号：ZLI-9031），TUNEL System试剂盒（美国Promega公司，批号：230684），分析纯Flu（美国Sigma公司，批号：20160225），RNA 逆转录试剂盒（日本TaKaRa公司，批号：D6110A）。PCR引物由上海博亚生物技术有限公司合成，SP5 激光共聚焦显微镜（德国Leica公司），ABI9700RT-PCR 扩增仪（美国ABI公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 睾丸标本采集手术收集3组子代雄性大鼠睾丸，将睾丸用生理盐水洗净后切成数份，一份放置于液氮中保存；另一份在4%多聚甲醛中固定。

1.4.2 大鼠睾丸组织HE染色 将各组睾丸组织用4%多聚甲醛固定，脱水后石蜡包埋，切片行HE染色，观察其组织学形态差异。

1.4.3 TUNEL法取相应的睾丸组织玻片常规脱蜡水化，按照TUNEL System 试剂盒说明书进行操作，在荧光显微镜下观察摄像。每张切片随机选取5个视野进行观察，计算凋亡指数。凋亡指数=视野内阳性细胞数/视野内总细胞数×100%。

1.4.4 免疫组织化学法取大鼠睾丸组织标本，采用免疫组织化学SP 二步法进行检测。组织经4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋、切片、脱蜡、水化，加热修复，H2O2封闭，滴加适量稀释的大鼠c-Kit、Stra8、Scp3 抗体，4℃过夜，PBS 冲洗，加入生物素标记二抗室温孵育，DAB显色，封片后显微镜下观察。蛋白阳性反应呈棕色。

1.4.5 qRT-PCR采用Trizol 法提取大鼠睾丸组织总RNA，用逆转录试剂盒逆转录合成cDNA 模板，反应体系配制及反应条件严格按照试剂盒说明书进行操作。以cDNA为模板进行qRT-PCR 反应，实验重复3次，采用2－ΔΔCt法计算Stra8、c-Kit、Scp3 mRNA相对表达量。

1.4.6 Western blotting提取大鼠睾丸组织总蛋白，经BCA 法蛋白定量后上样，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、转膜，取出聚偏二氟乙烯膜，丽春红染液，封闭2 h。分别加入一抗稀释液，漂洗，加入二抗孵育2 h后，Tris-HCl 缓冲盐溶液漂洗，最后显影。用Image J 软件分析蛋白条带灰度，以目的蛋白条带灰度值与β-actin 内参条带灰度值的比值表示Stra8、c-Kit、Scp3、PLZF 蛋白相对表达量。

1.5 统计学方法

数据处理采用SPSS 20.0 统计软件。计量资料以均数±标准差 （±s）表示，比较用方差分析，两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 隐睾和合并畸形情况

模型组和干预组隐睾大鼠模型复制成功，睾丸均位于腹股沟区。模型组单侧隐睾6例，双侧隐睾4例，均合并尿道下裂。干预组单侧隐睾5例，双侧隐睾5例，8例合并尿道下裂。

2.2 大鼠睾丸组织学形态差异

与对照组相比，模型组睾丸各级生精细胞数目减少、排列紊乱；管腔中央无絮状精子形成，且曲细精管管腔间隙变大，管腔明显缩窄。对照组和干预组中发现大量精子细胞及絮状精子，且各层生精细胞排列整齐。见图1。

图1 3组子代大鼠睾丸组织学形态 （HE染色×400）

2.3 生精细胞凋亡情况

TUNEL 法检测结果显示，模型组可见大量生精细胞凋亡，而对照组和干预组生精细胞凋亡数较少（见图2）。对照组、模型组、干预组凋亡指数分别为（0.10±0.09）、（0.25±0.11）和（0.11±0.08），经方差分析，差异有统计学意义（F=8.678，P=0.000）；对照组和干预组低于模型组（P＜0.05）。

2.4 睾丸组织中c-Kit、Stra8、Scp3 蛋白的表达

与对照组相比，模型组c-Kit、Stra8、Scp3 蛋白表达水平下降，而干预组视黄酸干预后c-Kit、Stra8、Scp3 蛋白表达较模型组上升，趋于正常。见图3。

2.5 3组大鼠睾丸组织中Stra8、c-Kit、Scp3 mRNA相对表达量比较

3组大鼠睾丸组织中Stra8、c-Kit、Scp3 mRNA相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组和干预组高于模型组（P＜0.05）。见表1。

2.6 3组大鼠睾丸组织中Stra8、c-Kit、Scp3、PLZF 蛋白相对表达量比较

3组大鼠睾丸组织中Stra8、c-Kit、Scp3、PLZF蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）；对照组和干预组高于模型组（P＜0.05）。见表2和图4。

图2 3组大鼠出生后30 d 睾丸内生精细胞凋亡情况 （TUNEL×400）

图3 3组大鼠睾丸组织中c-Kit、Stra8、Scp3 蛋白的表达 （免疫组织化学染色×400）

表1 3组大鼠睾丸组织中Stra8、c-Kit、Scp3 mRNA相对表达量比较 （n=10，x±s）

表2 3组大鼠睾丸组织中Stra8、c-Kit、Scp3、PLZF蛋白相对表达量比较 （n=10，x±s）

图4 3组大鼠睾丸组织中Stra8、Scp3、c-Kit、PLZF蛋白的表达

3 讨论

隐睾常见并发症包括不育及生育力下降。研究隐睾的病理学变化及隐睾中生精细胞的增殖分化，对治疗男性不育有重要意义。许多隐睾的研究来自于临床活检[6]，但来源的限制使研究并不能够完整地反映睾丸组织病变情况。所以本研究采用Flu 孕期给药，成功复制子代隐睾大鼠。视黄酸在生精过程中发挥重要作用，其作为维生素A的活性代谢产物，参与精子形成的各个阶段调控。因此，本研究采用视黄酸作为干预剂，明确视黄酸是否能够调控隐睾生精细胞增殖分化及减数分裂。

本研究中，模型组大鼠睾丸组织形态学改变明显。HE染色结果显示，模型组睾丸各级生精细胞数目减少、排列紊乱；管腔中央无絮状精子形成，且曲细精管管腔间隙变大、管腔明显缩窄，与既往报道相符[7]。而对照组和干预组中发现大量精子细胞及絮状精子，且各层生精细胞排列整齐。TUNEL 检测结果显示，与对照组相比，模型组中可见大量生精细胞凋亡。与模型组相比，干预组生精细胞凋亡指数大幅下降，与HE染色结果基本一致，证实隐睾睾丸出现明显病理改变，生精细胞凋亡增多，支持细胞间的紧密结构被破坏，精子数量下降，这可能是产生生育障碍的重要原因，而视黄酸能够恢复隐睾睾丸的生精环境，抑制生精细胞凋亡。

精原干细胞的分裂具有不对称性，在分化同时自我复制，这样的增殖和分化是生精过程不断持续的基础，但这个过程受到很多因子的调控。目前研究比较多的是Stra8、Scp3、c-Kit和PLZF，其中Stra8、Scp3是减数分裂的关键因子，c-Kit、PLZF与增殖分化关系密切。Stra8是视黄酸的目标基因，被认为是减数分裂的启动基因，其在生精细胞从有丝分裂向减数分裂转换过程中表达上调[8-9]。有报道指出，精母细胞在Stra8 缺失情况下将停留在DNA 复制阶段，减数分裂无法启动，导致精子形成障碍[10]。Scp3是生精细胞减数分裂的标志基因，参与染色体联会复合体的组成[11]。据研究报道，Scp3基因变异可能导致无精症[12]。PLZF在精原干细胞增殖过程中发挥重要作用[13-15]，参与精原干细胞的自我复制，维持其数量。c-Kit 在精原细胞分化过程中与其配体SCF 一起发挥重要作用[16-18]，其表达水平反映精原细胞分化活动的强弱。本研究中免疫组织化学和qRT-PCR 反应结果显示，与对照组相比，模型组大鼠睾丸组织中c-Kit、Stra8、Scp3 蛋白和mRNA相对表达量降低，而视黄酸干预后大鼠睾丸组织中c-Kit、Stra8、Scp3 蛋白和mRNA相对表达量升高，趋于正常水平；Western blotting 检测结果显示，模型组Stra8、Scp3、c-Kit及PLZF 蛋白相对表达量低于对照组和干预组，与免疫组织化学和qRT-PCR反应结果基本一致。隐睾组织中Stra8、Scp3 蛋白和mRNA表达减少，提示隐睾减数分裂被终止，无法继续进行；在补充视黄酸后Stra8、Scp3表达上升，提示视黄酸能恢复隐睾减数分裂。隐睾组织中PLZF 蛋白、c-Kit 蛋白和mRNA表达下调，表明隐睾精原细胞的增殖、分化出现问题，而视黄酸干预后其蛋白表达上调，与对照组差异不大，说明视黄酸能促进精原细胞增殖、分化。

综上所述，本研究通过隐睾大鼠模型，证实睾丸病理结构的改变可能是其生殖障碍的重要原因。模型组睾丸生精细胞的增殖分化和减数分裂能力较对照组明显下降，而视黄酸干预后Stra8、Scp3、c-Kit、PLZF 蛋白及Stra8、Scp3、c-Kit mRNA表达水平上升，提示视黄酸能促进生精细胞发育，为隐睾生精障碍的预防、治疗带来希望。