薛立芝，张思泉

（杭州市西溪医院 1.检验科，2.重症医学科，浙江 杭州 310023）

乙型肝炎病毒感染在世界范围内流行，慢性乙型肝炎患者中有约1/3 患者最终会发展为肝硬化或肝细胞癌等严重并发症。我国是乙型肝炎病毒感染率比较高的国家之一，我国≥50%肝癌是由长期慢性乙型肝炎病毒感染所致。慢性乙型肝炎发病机制复杂，表观遗传学在慢性乙型肝炎的发病中具有重要作用，DNA甲基化为表观遗传学的重要组成部分，为基因转录表达的调控方式之一；在慢性乙型肝炎发病中存在DNA 异常甲基化[1]。DNMT1为体细胞内最丰富的甲基转移酶之一，其具有维持DNA甲基化的作用；DNMT1 异常可导致基因组稳定性下降、原癌基因活性增高、抑癌基因功能丧失，从而在多种疾病及恶性肿瘤的发生、发展中发挥重要作用[1-2]。

研究发现，原发性肝癌患者肝组织中DNMT1表达升高，肝组织中DNMT1表达与患者乙型肝炎、肿瘤复发和转移等临床病理特征关系密切[3]。介于乙型肝炎为肝癌发病的主要原因，DNMT1 在乙型肝炎中的表达及意义值得探讨。本文对慢性乙型肝炎患者血清DNMT1水平及其临床意义进行研究，为临床治疗提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年1月—2019年12月在杭州市西溪医院就诊的慢性乙型肝炎患者120例作为乙型肝炎组，同期120例健康体检者作为对照组。乙型肝炎组男性71例，女性49例；年龄（46.37±9.61）岁。对照组男性68例，女性52例；年龄（45.93±10.52）岁。纳入标准：①乙型肝炎组患者有乙型肝炎病史；②＞6个月乙肝表面抗原阳性史；③对照组肝功能、乙肝两对半及乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）DNA 均正常。排除标准：①自身免疫性肝炎、酒精性肝炎、药物性肝炎等其他肝病；②丙型肝炎、丁型肝炎及戊型肝炎等其他类型肝炎；③并发肝癌，严重心、肺、肾等脏器疾病；④恶性肿瘤。本研究通过医院伦理委员会批准所有患者知情同意参与研究。两组年龄、性别比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 肝脏活检对慢性乙型肝炎患者进行常规肝脏活检，参照Metavir评分系统进行肝炎症程度和肝纤维化程度评估：肝炎活动度为≤G2为轻度炎症活动，G3及G4为重度炎症；肝纤维化分期为≤S2 期为轻度肝纤维化，S3 期和S4 期为重度肝纤维化。根据上述评估将慢性乙型肝炎患者分为轻度炎症组52例和重度炎症组68例；轻度纤维化组56例和重度纤维化组64例。

1.2.2 各指标测定谷草转氨酶（aspartate aminotransferase,AST）、谷丙转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）、总胆红素（total bilirubin,TBIL）、对数乙肝病毒（log hepatitis B virus,Log HBV）由杭州市西溪医院检验科检验；血清肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、DNMT1水平采用ELISA法测定（试剂盒购自美国Sigma公司），具体方法：用纯化人TNF-α、DNMT1 抗体包被微孔板，往包被微孔中加入TNF-α、DNMT1，与辣根过氧化物酶标记的TNF-α、DNMT1 抗体结合形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，加入底物3，3'，5，5'-四甲基联苯胺显色，3，3'，5，5'-四甲基联苯胺在辣根过氧化物酶的催化下转为蓝色；在酸的作用下最终转化为黄色，颜色深浅与TNF-α、DNMT1含量呈正相关。采用酶标仪测定450 nm 波长处光密度值，通过标准曲线计算TNF-α、DNMT1水平。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0 统计软件。计量资料以均数±标准差 （±s）表示，比较用t检验；相关性分析用Pearson 法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组生物化学指标和血清DNMT1水平比较

两组血清AST、ALT、TBIL、TNF-α和DNMT1水平比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），乙型肝炎组高于对照组。见表1。

2.2 乙型肝炎患者血清DNMT1与AST、ALT、TBIL及TNF-α的相关性分析

乙型肝炎患者血清DNMT1水平与AST、ALT、TBIL及TNF-α 呈正相关（P＜0.05）。见表2。

表1 两组生物化学指标和血清DNMT1水平比较 （n=120，±s）

表1 两组生物化学指标和血清DNMT1水平比较 （n=120，±s）

组别 AST/（u/L）ALT/（u/L）TBIL/（μmol/L）TNF-α/（nmol/L）DNMT1/（μg/L）对照组 15.12±2.26 16.34±2.64 8.42±1.05 1.12±0.24 24.46±5.74乙型肝炎组 52.61±2.86 85.31±3.02 20.53±1.22 3.14±0.33 35.71±6.02 t值 112.665 188.353 82.416 54.229 14.816 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.3 乙型肝炎E抗原阳性组与阴性组生物化学指标和血清DNMT1水平比较

乙型肝炎E抗原（HBeAg）阳性组与HBeAg阴性组AST、ALT、TBIL、TNF-α、Log HBV和DNMT1比较，经t检验，差异有统计学意义（P＜0.05），HBeAg阳性组高于HBeAg阴性组。见表3。

表3 HBeAg阳性组与阴性组生物化学指标和血清DNMT1水平比较 （±s）

表3 HBeAg阳性组与阴性组生物化学指标和血清DNMT1水平比较 （±s）

组别 n AST/（u/L）ALT/（u/L）TBIL/（μmol/L）TNF-α/（nmol/L）Log HBV DNMT1/（μg/L）HBeAg阴性组 71 36.57±2.65 44.12±3.24 19.65±3.71 2.49±0.41 2.77±0.32 31.51±4.32 HBeAg阳性组 49 65.64±3.07 122.61±3.78 21.03±3.87 3.82±0.47 5.64±0.38 44.19±4.18 t值 55.341 121.799 2.110 16.447 44.706 16.023 P值 0.000 0.000 0.037 0.000 0.000 0.000

2.4 HBeAg阳性患者血清DNMT1与AST、ALT、TBIL、TNF-α及Log HBV的相关性分析

HBeAg阳性患者血清DNMT1水平与AST、ALT、TBIL、TNF-α及Log HBV 呈正相关（P＜0.05）。见表4。

表4 HBeAg阳性患者血清AST、ALT、TBIL、TNF-α及Log HBV与DNMT1的相关性

2.5 不同肝组织炎症程度患者血清DNMT1水平比较

轻度炎症组与重度炎症组患者血清DNMT1水平分别为（29.16±3.13）、（40.36±3.21）μg/L，经t检验，差异有统计学意义（t=19.145，P=0.000），重度炎症组高于轻度炎症组。

2.6 不同肝纤维化程度患者血清DNMT1水平比较

轻度纤维化组与重度纤维化组患者血清DNMT1水平分别为（31.62±3.27）和（39.17±3.38）μg/L，经t检验，差异有统计学意义（t=12.394，P=0.000），重度纤维化组高于轻度纤维化组。

3 讨论

表观遗传指在未改变基因序列的情况下基因表达发生改变，即细胞内遗传信息外的遗传物质发生了改变，更重要的是这种遗传物质的改变在细胞的增殖、生长中可以稳定传递给子代[4]。目前发现的非基因序列变化的表观遗传分子机制有DNA甲基化、组蛋白质修饰、RNA 干扰及组蛋白乙酰化等[5]。DNA甲基化为表观遗传学研究最多的机制之一，在哺乳动物中DNA甲基化主要通过DNMT1、DNMT3 等进行调节[6]。

DNA甲基化为重要的表观遗传学修饰形式之一，其中DNMT为催化DNA甲基化的重要调控分子[7]。DNMT 催化DNA甲基化可沉默抑癌基因，从而促进恶性肿瘤的发生、发展，DNMT1为DNMT的一种类型，在多种恶性肿瘤中过表达[8-10]。研究发现，DNMT1 在肝癌中也存在过表达[11]。乙型肝炎病毒感染为肝癌发病的主要原因，DNMT 在乙型肝炎中的作用也受到关注，如LI 等[11]研究发现，肝细胞癌中乙型肝炎病毒感染与DNMT表达关系密切，肝细胞癌组织中乙型肝炎病毒感染可上调DNMT表达[12]。康艳红等[13]研究发现，乙型肝炎病毒X 蛋白转录激活细胞DNMT 启动子，进而上调DNMT表达。KOSTYUSHEV 等[14]研究发现，慢性乙型肝炎患者DNMT 过表达。MADEDDU 等[15]研究发现，慢性乙型肝炎患者DNMT1 对线粒体DNA甲基化状态具有调节作用。上述研究均表明DNMT 参与乙型肝炎的发病过程。

本研究对慢性乙型肝炎患者血清DNMT1水平进行研究，发现乙型肝炎组血清DNMT1水平高于对照组；HBeAg阳性组DNMT1水平高于HBeAg阴性组；慢性乙型肝炎患者血清DNMT1水平与AST、ALT、TBIL、TNF-α及Log HBV 呈正相关，与肝组织炎症活动程度和肝纤维化程度关系密切。慢性乙型肝炎患者HBeAg 血清学转化（即由阳性转化为阴性）为血清学的转折点，其转化提示患者慢性乙型肝炎病程发展缓慢、远期预后良好及肝硬化发病率降低，患者经过治疗后HBeAg 血清学转化表示抗病毒治疗效果良好。AST、ALT、TBIL为肝功能的常用指标，其水平升高表明患者肝功能异常。TNF-α为常用的炎症指标，其水平升高表明机体炎症反应程度升高。由此可见，DNMT1 可能参与慢性乙型肝炎的发病过程，血清DNMT1水平在一定程度上可反映患者的肝功能损伤程度、炎症活动程度和纤维化程度、预后及疗效。

综上所述，慢性乙型肝炎患者血清DNMT1水平升高，检测血清DNMT1水平在患者肝功能损伤、炎症程度、纤维化程度和预后评估中具有一定参考价值。