李豪 姬发祥 徐晓宁 马金华 沈存芳 李进章 王丽娟

(青海大学附属医院肿瘤内科，青海 西宁 810000)

结直肠癌是常见的消化道肿瘤，其发病率和死亡率不断上升〔1〕；是世界第3高发恶性肿瘤，严重威胁人类的健康〔2〕。现在其主要治疗方式是手术、放疗和化疗〔3〕，新型的分子靶向治疗药物贝伐单抗、西妥昔单抗的联合应用对于结直肠癌有良好的疗效〔4〕。因此，分子靶向治疗对结直肠癌的治疗具有重要临床意义。长链非编码RNA(lncRNA)是长度大于200 nt的非编码RNA，近年来研究发现lncRNA广泛参与调控肿瘤细胞的增殖、凋亡和侵袭迁移等〔5，6〕。lncRNA HOTAIR在结直肠癌中高表达会增加细胞侵袭，易出现肝脏转移且预后较差〔7〕。

肿瘤易感候选基因(CASC)2是lncRNA的一种，最初在子宫内膜癌中发现，呈下调表达有抑癌作用〔8，9〕。研究发现CASC2在肺癌〔10〕、肝癌〔11〕、结肠癌〔12〕、食管癌〔13〕、胰腺癌〔14〕、胃癌〔15〕、肾细胞癌〔16〕、膀胱癌〔17〕、胶质瘤〔18〕、甲状腺癌〔19〕中下调表达有抑癌作用，可作为肿瘤诊治的生物学标志物。lncRNA除了直接参与基因的表达调控外，也可作为一种竞争性内源RNA与miRNA相互调控，共同参与靶基因的表达，并在肿瘤的发生发展中发挥重要作用〔20，21〕。本研究探寻lncRNA CASC2对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响，分析CASC2和miR-514b-5p的靶向关系。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 人正常结肠黏膜上皮细胞NCM460和结直肠癌细胞SW480均购自中国科学院上海细胞库。胎牛血清(FBS)、RPMI1640培养基均购自美国Gibco公司；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒和qPCR试剂盒购自日本Takara公司；LipofectamineTM2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司；细胞计数试剂盒(CCK)-8购自碧云天生物技术研究所；细胞板、酶标仪购自赛默飞公司；倒置显微镜购自Olympus公司。

1.2细胞培养 人正常结肠黏膜上皮细胞NCM460和结直肠癌细胞SW480常规培养于含10% FBS的RPMI1640培养基，置于37℃，含5% CO2恒温箱培养。每2～3 d传代一次。

1.3细胞转染和分组 取常规培养的人乳腺癌细胞SW480消化后接种于96孔板中，待细胞生长至80%融合，更换为无血清培养基同步化12 h，随后进行转染。转染分为pcDNA组(转染pcDNA)、pcDNA-CASC2组(转染pcDNA-CASC2 mimics)、si-NC组(转染si-NC)、si-CASC2组(转染si-CASC2)、anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC)、anti-miR-514b-5p组(转染anti-miR-514b-5p)、pcDNA-CASC2+miR-NC组(共转染pcDNA-CASC2 mimics和miR-NC)、pcDNA-CASC2+miR-514b-5p组(共转染pcDNA-CASC2 mimics和miR-514b-5p)，转染按照LipofectamineTM2000试剂盒进行操作。

1.4qRT-PCR分析CASC2及miR-514b-5p表达 按照说明书提取总RNA，用反转录试剂盒逆转录成cDNA，按照qPCR说明书进行qRT-PCR方法扩增。循环条件为95℃ 30 s，60℃ 30 s；72℃ 30 s，共40个循环；60℃延长5 min。相对表达量采用2-△△Ct法计算。

1.5CCK-8法测定SW480细胞增殖 分别取pcDNA组、pcDNA-CASC2组、anti-miR-NC组、anti-miR-514b-5p组、pcDNA-CASC2+miR-NC组和pcDNA-CASC2+miR-514b-5p组对数生长期细胞的消化后，接种于96孔板(5×103个/孔)培养，分别于24、48和72 h培养时间点，每孔加入10 μl CCK-8试剂继续孵育2 h。酶标仪测定各孔490 nm波长处OD值。每组重复3次取平均值，另设单孔只加培养基作空白对照。细胞增殖活力(%)=(实验组OD值-空白对照组OD值)/空白对照组OD值×100%。

1.6Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力 收集pcDNA组、pcDNA-CASC2组、anti-miR-NC组、anti-miR-514b-5p组、pcDNA-CASC2+miR-NC组和pcDNA-CASC2+miR-514b-5p组稳定表达的SW480细胞，配制不含血清的细胞培养液，饥饿去血清后取适量悬液加入Transwell小室上层(3×105个/孔)，下室加含有趋化因子的培养基，继续培养48 h。用棉签擦去上室内的细胞，再用0.1%的结晶紫染色；细胞侵袭实验在Transwell小室上层加入基质胶Matrigel，凝固后接种SW480细胞，之后和细胞迁移操作相同。显镜下随机选取5个视野进行细胞的观察、计数。

1.7荧光素酶报告基因检测 CASC2对miR-514b-5p的转录调控 TargetScan数据库显示CASC2 3′UTR区域有miR-613结合位点。构建野生型和突变型基因靶点CASC2的3′UTR-荧光素酶表达载体(WT-CASC2和MUT-CASC2)，取对数生长期SW480细胞接种于24孔板(5×104个/孔)，待细胞生长至80%融合时，用LipofectamineTM2000将WT-CASC2和MUT-CASC2组细胞分别转染miR-NC和miR-514b-5p。依据说明书要求，使用荧光素酶报告基因检测仪进行双荧光素酶报告实验测定。实验结果以荧光素酶活性和Renilla活性的比值进行统计学分析。实验重复3次。

1.8统计学分析 采用SPSS20.00软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1CASC2和miR-514b-5p在SW480细胞和NCM460细胞中的表达 与NCM460组相比，SW480组细胞中CASC2表达显著下降；miR-514b-5p的表达水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 CASC2和miR-514b-5p在SW480细胞和NCM460细胞中的表达

2.2CASC2过表达对结直肠癌SW480细胞增殖的影响 CCK-8法检测结果显示，在转染pcDNA、pcDNA-CASC2后，分别于24、48、72 h时检测细胞增殖，与pcDNA组相比，在48 h和72 h时pcDNA-CASC2组SW480细胞活性显著降低(P<0.05)。qRT-PCR检测结果显示，相较于pcDNA组，pcDNA-CASC2组CASC2的表达显著升高(P<0.05)。见表2。

表2 CASC2过表达对结直肠癌SW480细胞增殖的影响

2.3CASC2过表达对结直肠癌SW480细胞迁移、侵袭的影响 Transwell 法检测结果显示，相较于pcDNA组，pcDNA-CASC2组结直肠癌SW480细胞迁移和侵袭数量显著降低(P<0.05)。见表3。

表3 CASC2过表达对结直肠癌SW480细胞迁移、侵袭的影响个)

2.4抑制miR-514b-5p表达对结直肠癌SW480细胞增殖、迁移、侵袭的影响 qRT-PCR检测结果显示，相较于anti-miR-NC组，anti-miR-514b-5p组结直肠癌SW480细胞miR-514b-5p的表达显著降低(P<0.05)。CCK-8法检测结果显示，相较于anti-miR-NC组，anti-miR-514b-5p组结直肠癌SW480细胞在作用48 h和72 h时细胞活性显著降低(P<0.05)。Transwell法检测结果显示，相较于anti-miR-NC组，anti-miR-514b-5p组结直肠癌SW480细胞迁移和侵袭数量显著降低(P<0.05)。见表4。

表4 抑制miR-514b-5p表达对结直肠癌SW480细胞增殖、迁移、侵袭的影响

2.5CASC2靶向调控miR-514b-5p的表达 通过TargetScan数据库预测到CASC2与miR-514b-5p存在结合位点(图1)。荧光素酶报告基因检测实验结果显示，转染野生型CASC2基因表达载体WT-CASC2后，相较于miR-NC组，miR-514b-5p组WT-CASC2乳腺癌细胞的荧光素酶活性显著降低(P<0.05)；而转染突变型CASC2基因表达载体MUT-CASC2后，相较于miR-NC组，miR-514b-5p组MUT-CASC2 乳腺癌细胞的荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05)，见表5。qRT-PCR检测结果显示，相较于si-NC组(0.96±0.09)，si-CASC2组乳腺癌细胞中miR-514b-5p的表达水平(2.14±0.17)显著升高(P<0.05)；而相较于pcDNA组(1.03±0.08)，pcDNA-CASC2组乳腺癌细胞中miR-514b-5p的表达水平(0.52±0.05)显著降低(P<0.05)。

表5 双荧光素酶报告实验

图1 CASC2的3′UTR中含有与miR-51b-5p互补的核苷酸序列

2.6miR-514b-5p过表达逆转了CASC2过表达对SW480细胞增殖、迁移、侵袭的作用 CCK-8法检测结果显示，在转染pcDNA、pcDNA-CASC2、pcDNA-CASC2+miR-NC和pcDNA-CASC2+miR-514b-5p后，在48 h和72 h时，相较于pcDNA组，pcDNA-CASC2组SW480细胞活性显著降低(P<0.05)；而相较于pcDNA-CASC2+miR-NC组，pcDNA-CASC2+miR-514b-5p组SW480胞活性显著升高(P<0.05)。Transwell 法检测结果显示，相较于pcDNA组，pcDNA-CASC2组SW480细胞迁移和侵袭数显著降低(P<0.05)；而相较于pcDNA-CASC2+miR-NC组，pcDNA-CASC2+miR-514b-5p组SW480细胞迁移和侵袭数显著升高(P<0.05)。见表6。

表6 miR-514b-5p过表达逆转了CASC2过表达对SW480细胞增殖、迁移、侵袭的作用

3 讨 论

结直肠癌严重威胁人类生命健康，其治疗方式主要是手术和放化疗，而近年来分子靶向治疗有良好的疗效，明显改善患者生存质量〔22〕。所以确定更多更精确的靶点，对更有效的结直肠癌诊断治疗和预后意义重大。lncRNA可作为肿瘤临床诊断标志物和治疗靶点〔23〕。研究发现，lncRNA CASC2作为竞争性内源RNA调控miR-18a，在结肠直肠癌中发挥作用〔12〕；CCAT2在结直肠癌中高表达，促进肿瘤生长和迁移，诱导染色体不稳定〔24〕。CASC2通过靶向miR-18a-5p调节PTEN的表达抑制食管癌肿瘤的增殖和侵袭〔25〕。研究发现，CASC2能负向调控miR-24-3p抑制肝癌细胞的活力，促进其凋亡〔26〕；CASC2通过调控miR-367影响下游靶基因进而抑制肝癌细胞的迁移和侵袭〔27〕；CASC2通过miR-21抑制人神经胶质瘤的生长〔28〕；CASC2通过抑制SOX4抑制肺腺癌的迁移和上皮至间充质转变〔29〕。HNF1A/CASC2通过PTEN/Akt信号传导调节胰腺癌细胞增殖〔30〕；CASC2通过调节MAPK信号传导途径抑制胃癌细胞的增殖〔15〕。

miRNA参与多种生物学功能，miR-100-5p和miR-199b-5p通过靶向mTOR诱导结肠癌细胞自噬〔31〕。miR-18b-5p在大肠癌中高表达，通过下调PTEN的表达，激活PI3K/Akt2信号转导通路促进大肠癌的发生发展〔32〕。miR-499-5P在结肠癌中高表达，参与结肠癌早期的发生发展，与淋巴结的转移有关〔33〕。miR-514b-5p通过促进上皮细胞-间充质转化促进结直肠癌的迁移〔34〕。miR-513b-5p〔35〕、miR-139-5p〔36〕、miR-338-5p〔37〕可以通过阻滞细胞周期，促进细胞凋亡等抑制结肠癌细胞的增殖、迁移与侵袭。

本研究发现，lncRNA CASC2可抑制结直肠癌SW480细胞的增殖、迁移和侵袭，其机制可能与靶向调节miR-514b-5p的表达有关，对CASC2调控作用机制的研究将可为结直肠癌的预防诊断、预后评估及靶向治疗提供新的理论依据和干预靶点。