周姝 白冰 张宗敏 徐靖宇 金海

(遵义医科大学附属医院 1肾病风湿科，贵州 遵义 563000；2综合病房；3消化内科)

原发性肝癌(PLC)是常见恶性肿瘤之一，2015年我国癌症中心数据显示，PLC是60岁以下男性最常见和病死率最高的癌症〔1〕。近90% 的PLC为肝细胞性肝癌，其恶性程度高、病情发展快，其发病率及死亡率均呈逐年上升趋势，严重威胁民众的生命健康〔2〕。研究发现，PLC的发生及预后均与患者性别存在相关性，肝癌男性的发病率明显高于女性，且女性患者的预后相对较好〔3,4〕，另有研究证实，雌激素受体(ERs)在肝癌组织中异常高表达〔5〕。以上研究均提示肝癌的发生、发展可能与雌激素相关，但其相关分子机制至今仍未完全阐明，探究雌激素在肝癌疾病发生和疾病进展中的潜在分子机制是目前肿瘤研究领域的热点之一。本研究旨在探究雌激素对肝细胞癌细胞增殖和凋亡的影响，以期为雌激素抗肝癌治疗提供新的基础研究数据。

1 材料与方法

1.1细胞培养 人肝癌细胞株SMMC7721、HepG2、Bel-7404、huh7、MHCC-97L、MHCC-97H、PLC、LM3、SK-HEP-1、Bel-7402(中国科学技术研究院上海细胞库)，采用DMEM完全培养基(含10%胎牛血清)，培养于5% CO2恒温、饱和湿度的细胞培养箱，以细胞复苏后4代以后的细胞为研究对象。

1.2琼脂糖凝胶电泳 Trizol溶液提取细胞内总RNA，微量紫外荧光分光光度计检测RNA浓度和纯度(OD260/OD280)。逆转录试剂盒，50℃，15 min；85℃，2 min，将RNA逆转录为cDNA，产物置于-20℃冰箱保存。以cDNA为模板，采用ERα和ERβ特异性引物，引物序列如下，ERα正向引物5′-CAG GCT TTG TGG ATT TGA CC-3′，ERα反向引物5′-AGA GAC TTC AGG GTG CTG GA-3′，扩增长度313 bp；ERβ正向引物5′-AGG CTG CGA GAA ATA ACT GC-3′，ERβ反向引物5′-GCA AGA AGA GGC ACA AA GGT-3′，扩增长度320 bp；进行聚合酶链反应(PCR)，PCR产物置于-20℃冰箱保存。

Tris-硼酸(TBE)缓冲液(1×)制备2%琼脂糖凝胶，加入适量的凝胶红，取PCR产物与上样缓冲液混匀后，上样，15 V/cm电泳25 min，凝胶成像仪上观察电泳结果，采集图像。

1.3Western印迹 收集细胞沉淀，加入RIPA细胞裂解液，冰上孵育30 min，4℃条件下12 000 r/min离心20 min，收集上清液，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)试剂盒检测蛋白浓度；十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离蛋白后，转移蛋白至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脱脂奶粉室温孵育1 h后，分别加入兔抗人ERα和ERβ一抗工作液(稀释比例1∶1 000，美国Abcam公司)，4℃孵育过夜，含吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBS-T)洗涤3次后，分别加入鼠抗兔辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗工作液(稀释比例1∶5 000，北京博奥森生物技术有限公司)，4℃孵育40 min，PBS-T洗涤3次后，电化学发光(ECL)液显色反应，采集图像。

1.4四唑盐(MTT)实验 将处于对数生长期的细胞，制备成细胞悬液(约1×105个/ml)，取100 μl细胞悬液，接种于96孔板中，每组设置4个平行复孔，孵育16～24 h后，弃去旧培养液，每组加入100 μl含有不同浓度雌激素(0.00、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00、160.00 μmol/L)的完全培养液，培养24 h、48 h、72 h后，弃上清，每孔加入100 μl MTT溶液(5 mg/ml)，孵育4 h，酶标仪490 nm处检测吸光度值(OD490)。细胞增殖抑制率(IR)=(OD空白对照组-OD雌激素组)/OD空白对照组×100%。

1.5细胞凋亡实验

1.5.1Tunel染色实验 将处于对数生长期的细胞，制备成细胞悬液(约2×105个/ml)，取1.5 ml细胞悬液，接种于6孔板中，孵育16～24 h后，弃去旧培养液，每组加入100 μl含有不同浓度雌激素(0、10 μmol/L)的完全培养液，培养48 h后，弃上清弃去旧培养液，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞1次，4%多聚甲醛固定细胞30～60 min，PBS洗涤细胞1次，加入Triton-100细胞裂解液(0.1%)，冰上孵育2 min，PBS洗涤细胞2次，加入Tunel染色液，避光孵育30 min，PBS洗涤细胞3次，荧光显微镜下观察、拍照，并对阳性染色细胞(即凋亡细胞)和总细胞进行计数，计算凋亡细胞占总细胞数的百分比。

1.5.2膜联蛋白(Annexin)V-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(PI)双染实验 将处于对数生长期的细胞，制备成细胞悬液(约2×105个/ml)，取1.5 ml细胞悬液，接种于6孔板中，孵育16～24 h后，弃去旧培养液，每组加入100 μl含有不同浓度雌激素(0.00、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00、160.00 μmol/L)的完全培养液，培养24 h、48 h后，弃上清，0.25%胰酶〔不含乙二胺四乙酸(EDTA)〕消化后，收集细胞悬液，PBS缓冲液洗涤细胞1次，加入300 μl结合缓冲液重悬细胞，加入5 μl的Annexin V-FITC混匀后，避光，室温孵育15 min，再加入5 μl的PI染色，室温孵育5 min，30 min内进行流式检测，收集流式细胞术直方图并进行结果统计。

1.6基因芯片技术 将处于对数生长期的细胞，制备成细胞悬液(约2×105个/ml)，取3.0 ml细胞悬液，接种于6 cm培养皿中，孵育16～24 h后，弃去旧培养液，每组加入3.0 ml含有不同浓度雌激素(0、20 μmol/L)的完全培养液，培养48 h后，收集细胞。采用RNA试剂盒，提取细胞总RNA，RNA纯化试剂盒进行纯化，微量紫外分光光度计检测RNA纯度及浓度，进行RT2 Profiler PCR Arrays基因表达分析。

1.7统计学分析 采用SPSS19.0软件进行双尾t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1ER在人肝细胞癌中的表达 ERα和ERβ的mRNA、蛋白在人肝细胞癌细胞SMMC7721、HepG2、Bcl-7404、huh7、MHCC-97L、MHCC-97H、PLC、LM3、SK-HEP-1、Bcl-7402中均有表达，见图1、图2。

图1 ERα和ERβ扩增产物的琼脂糖凝胶电泳

图2 ERα和ERβ蛋白的Western印迹显影

2.2不同浓度雌激素对人肝细胞癌增殖的影响 不同浓度雌激素分别处理SMMC7721、HepG2细胞24 h、48 h、72 h后，SMMC7721、HepG2细胞增殖均有不同程度的抑制，相同处理时间时及雌激素浓度增加，细胞增殖抑制率增高；相同雌激素浓度时，随着处理时间延长，细胞增殖抑制率呈增高趋势。见表1、表2和图2。

表1 不同浓度雌激素作用不同时间对SMMC-7721细胞增殖的影响

表2 不同浓度雌激素作用不同时间对HepG2细胞增殖的影响

2.3不同浓度雌激素对人肝细胞癌凋亡的影响

2.3.1Tunel法检测雌激素对HepG2和SMMC-7721细胞晚期凋亡的影响 0.00、10.00 μmol/L雌激素处理HepG2和SMMC-7721细胞48 h后，空白组细胞数量较多，其间极少量散在分布的Tunel染色阳性细胞；雌激素组细胞数量明显减少，形态明显发生变化(形态变为梭形或多角形)，细胞皱缩(体积明显缩小)，其间到处可见胞核及核周呈棕褐色即Tunel染色阳性的凋亡细胞或浓染的凋亡小体，细胞晚期凋亡率显著增加，见图3、表3。

表3 雌激素对Hep2G和SMMC7721晚期凋亡率的影响

2.3.2流式细胞仪检测雌激素对HepG2和SMMC-7721细胞凋亡的影响 与0.00 μmol/L浓度相比，1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00、160.00 μmol/L浓度雌激素均可诱导HepG2和SMMC-7721细胞凋亡，相同处理时间时，随着雌激素浓度增加，细胞凋亡率增高；相同雌激素浓度时，随着处理时间延长，细胞凋亡率增高；见表4。

表4 不同浓度雌激素作用不同时间对HepG2、SMMC7721细胞凋亡率的影响

2.4雌激素对肝细胞癌细胞凋亡相关蛋白的影响 与0.00 μmol/L相比，20.00 μmol/L雌激素处理SMMC-7721细胞48 h后，BRI1相关受体激酶(BAK1)〔(5.0±0.42)μmol/L〕、生长停滞和DNA损伤诱导蛋白(GADD45A)〔(5.4±0.71)μmol/L〕、HRK〔(4.03±0.53)μmol/L〕、淋巴毒素-α(LTA)〔(5.13±0.60)μmol/L〕、肿瘤坏死因子受体超家族成员10A(TNFRSF-10A)〔(4.29±0.41)μmol/L〕基因表达上调。

3 讨 论

肝癌是我国高发的、危害极大的恶性肿瘤，我国的肝癌患者约占全世界肝癌的50%，肝癌在各年龄段均有发生，但多见于中老年患者，近年来有年轻化的趋势〔6〕。尽管目前治疗肝癌的方法众多，但疗效依然有待提高，患者的预后不容乐观，因此探究新的治疗策略尤为重要。据流行病学统计，我国肝癌的年均发病率男性为39.42/10万人，女性为13.63/10万人，而年均死亡率男性为36.41/10万人，女性13.37/10万人，由此可见女性的肝癌发病率明显低于男性，且生存情况优于男性，可见性别对肝癌的发生、发展有一定影响〔7〕。此外，ER基因ESR1的基因多态性与乙型肝炎病毒的慢性感染相关〔8〕。因此可以推测，性别差异导致肝癌发病率的差异可能与性激素，主要是雌激素有关。

雌激素是具有广泛生物活性的类固醇激素，包括雌二醇、雌三醇及雌酮等，主要由卵巢和胎盘分泌，在肝脏、脂肪和肾上腺皮质等外周组织中也有生成〔9，10〕；雌激素不仅可以促进生殖器官成熟，而且也参与了个体正常生长发育，与多种生理病理过程相关〔11〕。雌激素主要通过ER相关信号通路发挥生理功能。ER包括经典的核受体和膜受体两大类，包括ERα、ERβ两种亚型，二者的结构相似，但在组织分布和表达量方面则随性别、年龄有所区别；ERα、ERβ在不同组织中的含量及生物功能也有不同，而在消化系统中，ERα主要分布于肝脏〔12〕，ERβ主要分布于胃肠道〔13〕。雌激素对肝脏形态的建成、功能发挥重要作用，此外，肝脏也是性激素代谢转化的重要器官，芳香化酶可将雌激素转化为雌三醇和雌酮〔14〕；同时，肝脏是激素敏感性器官，雌激素比例失衡可能是诱导肝癌的因素之一，ER在肝癌组织中呈高表达状态，因此ER有可能作为肝癌的重要诊断指标〔15〕。本研究采用普通PCR技术检测到ERα和ERβ mRNA在肝癌细胞株均有表达，同时Western印迹实验结果发现，ERα和ERβ蛋白质在肝癌细胞中均有表达。

肿瘤细胞增殖与凋亡失衡决定了肿瘤的生长速率。细胞凋亡即细胞程序性死亡，其在维持机体正常生长发育、维持机体内环境稳态方面发挥重要作用；诱导肿瘤细胞凋亡是当前抗肿瘤药研发的重要策略之一。Leitman等〔16〕在小鼠模型的研究发现，雌激素参与肝组织中一些基因调控，主要体现在肝细胞增殖的相关基因，因此本研究主要关注雌激素在肝细胞癌增殖和凋亡中的作用。本研究采用不同浓度雌激素处理人肝细胞癌细胞，不同浓度雌激素对肝癌细胞增殖均有不同程度抑制作用，且具有时间和剂量的依赖性；雌激素处理肝细胞癌细胞(SMMC7721、HepG2)，细胞晚期凋亡率及细胞仪Annexin V-FITC/PI实验结果显示，不同浓度总凋亡率增高，且存在时间剂量依赖性。以上实验结果均表明，雌激素可抑制肝癌细胞增殖、诱导细胞凋亡，提示雌激素具有抗肝癌功能。白细胞介素(IL)-6是重要的炎症因子，可起到促进肝癌细胞的增殖、侵袭和转移的作用，而雌激素是IL-6的有效抑制因子，生理剂量的雌激素即可明显减少IL-6的释放〔17〕；Wang等〔18〕的研究显示，雷洛昔芬(ER调节剂)可通过抑制IL-6/信号传导与转录激活因子(STAT)3信号传导促进肝癌细胞凋亡。另有研究显示，雌激素可通过调控核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3来抑制肝癌细胞增殖、迁移和集落形成能力〔19〕。

Kao等〔20〕研究发现，雌激素对肝脏的影响主要体现在转录水平；本研究基因芯片技术检测细胞中84个凋亡相关基因的表达变化，提示雌激素抑制肝癌细胞增殖、诱导细胞凋亡，可能与上调这些基因表达相关，但其诱导细胞凋亡的具体机制，有待在以后的实验中进一步完善。

综上所述，人肝癌细胞中存在ER表达，且雌激素能够抑制肝癌细胞增殖、诱导肝癌细胞凋亡。然而目前雌激素及其受体抑制肝癌发生、发展的具体作用机制尚未完全阐明，雌激素治疗仍存在争议，仍需进一步研究探索。