徐汉桥 潘捷 田学涛 陈志强 张玉萍

(1江汉大学附属医院武汉市六医院胸外科，湖北 武汉 430015；2华中科技大学协和江南医院武汉市江夏区第一人民医院消化科)

肺癌是世界第一大癌症，随着每年发病率的上升，死亡率高居恶性肿瘤首位，且女性患者数量也呈逐年上升趋势〔1～4〕。研究肺癌发生和发展的分子生物学机制，为肺癌的分子诊断和治疗提供新的靶点已成为其基础研究的热点。大量研究表明，在肺癌中miRNA通过调控下游基因控制癌细胞的增殖、迁移和侵袭及耐药性等〔5～7〕。miR-9-5p是一种高度保守的微小RNA，主要表达于中枢神经系统〔8〕，并调节其正常发育。miR-9-5p在宫颈癌、舌癌、乳腺癌中表达异常，与癌细胞的增殖、转移、侵袭有关〔9～11〕。miR-9-5p在非小细胞肺癌患者血清中表达上调，是肺癌诊断的潜在标志物〔12〕。金属蛋白酶ADAMTS18〔13〕在多种肿瘤组织中表达异常，如食管鳞状细胞癌、宫颈癌癌、乳腺癌、肾透明细胞癌等〔14～18〕。ADAMTS18在肺癌组织中通常呈现甲基化，过表达ADAMTS18可抑制肺癌细胞增殖、迁移和侵袭〔19〕。miR-9-5p和ADAMTS18在肺癌增殖、迁移和侵袭中都具有重要作用，而两者在肺癌中的关系尚不清楚。本课题拟研究 miR-9-5p影响A549细胞增殖、侵袭和迁移的分子机制及ADAMTS18在此机制中的作用，以期为肺癌的分子治疗提供新的靶标。

1 材料与方法

1.1材料 人肺癌细胞株A549和人正常支气管上皮细胞株HBE购自ATCC；胎牛血清(FBS)和DMEM培养基购自Gibco公司，牛血清白蛋白(BSA)、胰蛋白酶Trypsin、二甲基亚砜(DMSO)和四氮唑蓝(MTT)购自Sigma-Aldrich公司；Transwell板购自美国Corning公司；双荧光素酶报告系统购自美国Promega公司；Lipofectamine 2000转染试剂、Total RNA提取试剂盒、real-time PCR 试剂盒、反转录试剂盒(RT-PCR)购自美国Invitrogen公司；抗ADAMTS18抗体和GAPDH抗体购自Abcam；显微镜、酶标仪及Real-time PCR仪购自美国Bio-Rad公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒购自Thermo。

1.2细胞培养 用含10% FBS、1% 青-链霉素的DMEM培养基培养A549细胞，培养条件：37℃ 5% CO2培养箱中培养，湿度95%。培养细胞至对数生长期，消化传代。

1.3细胞转染 将对数生长期A549稀释至(1～2)×106个细胞/ml，200 μl细胞/孔接种于6孔板中，细胞培养至融合度为80%～90%时进行转染。先用无血清OptiMEM培养液稀释脂质体、miR-NC、miR-9-5p、anti-miR-NC、anti-miR-9-5p、pcDNA、pcDNA-ADAMTS18、anti-miR-9-5p+si-NC、anti-miR-9-5p+si-ADAMTS18、WT-ADAMTS18+miR-NC、WT-ADAMTS18+miR-9-5p、MUT-ADAMTS18+miR-NC和MUT-ADAMTS18+miR-9-5p的载体，之后取等体积脂质体和各组载体混合，室温孵育20 min，将混合液滴入到培养好的细胞孔板中，轻柔混匀，培养6 h，换成完全培养基，转染48 h后收集细胞。

1.4Real-time PCR检测mRNA表达 收集支气管上皮细胞和转染48 h的各组A549细胞(anti-miR-NC、anti-miR-9-5p组)，提取总RNA，保存于-80℃。然后按照反转录PCR试剂盒说明书合成cDNA，反应程序为16℃ 30 min、42℃ 30 min、72℃ 10 min；4℃放置10 min，合成的cDNA测定浓度和纯度后置于-80℃保存。取cDNA按照 real-time PCR的说明书进行反应，反应程序为：95℃ 6 min；95℃ 30 s、60℃ 40 s、72℃ 45 s，40个循环；72℃ 10 min。引 物 如 下：miR-9-5p 上 游：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，下游：5′-GCGCTCTTTGGTTATCTAGC-3′；ADAMTS18上游：5′-TGCACAACGGCAGGAAAAAG-3′，下游：5′-TCAAAATCGCCGAGGGCTTA-3′。运用Bio-Rad PCR系统进行数据分析。

1.5MTT实验测定细胞活性 A549细胞转染48 h后，收集细胞，Trypsin消化细胞，调整细胞浓度至1×104个/ml，200 μl/孔接种于96微孔板中，继续培养，分别在24、48、72 h进行 MTT 实验，每孔加入 20 μl(5 mg/ml)MTT，培养4 h，弃上清培养液，再在每孔加入150 μl DMSO，室温混匀5 min，酶标仪测定OD 490 nm 吸光度(A)值。

1.6Transwell实验检测细胞迁移和侵袭 迁移实验：转染后的各组A549细胞(anti-miR-NC组、anti-miR-9-5p组、pcDNA组、pcDNA-ADAMTS18组、anti-miR-9-5p+si-NC组、anti-miR-9-5p+si-ADAMTS18组)培养至对数生长期，收集细胞，加入含10 g/L BSA的无血清DMEM培养基，稀释细胞浓度为2×105个/ml。Transwell下层培养孔加入500 μl 10%FBS培养基作为迁移趋化物，Transwell上层小室中加入100 μl细胞，将上层小室放入下层培养孔中，培养48 h，用棉签拭去基质胶和上层小室的细胞，冰甲醛固定细胞，染色，显微镜观察计数。侵袭实验：以4℃无血清培养基1∶5比例稀释Matrigel，加入上层Transwell小室，烘干，以下步骤同迁移实验，上层小室加入100 μl细胞，下层加入500 μl 10%FBS培养基，培养48 h，固定细胞，染色，计数。

1.7双荧光素酶报告实验 A549细胞转染48 h，收集细胞，Trypsin消化，计数，以1×104个细胞/孔接种于24孔板中，继续培养24 h，观察若细胞融合度达到80%～90%，进行转染，分别构建ADAMTS18的野生型(WT-ADAMTS18)和突变型(MUT-ADAMTS18)双荧光素酶报告载体，分别共转染miR-NC或miR-9-5p，转染后培养48 h，收集细胞，用裂解缓冲液室温裂解20 min，离心收集上清，-20℃保存或直接加入荧光素酶底物，发光仪检测荧光素酶活性。以海肾荧光素酶活性为内参照，计算相对萤火虫荧光素酶活性。

1.8Western印迹实验 将HBE细胞和转染48 h后的各组A549细胞用RIPA裂解液裂解，冰浴超声破碎细胞，收集蛋白并检测浓度。进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转膜，室温封闭1 h，加入一抗ADAMTS18(1∶1 000)，4℃孵育过夜。洗膜2次，然后加入的二抗(1∶1 000)，室温孵育1 h。以GAPDH为内参照，分析蛋白水平。

1.9统计学处理 采用 SPSS21.0统计软件进行t检验和单因素方差分析。

2 结 果

2.1miR-9-5p和ADAMTS18在肺癌A549细胞和人正常支气管上皮细胞HBE中的表达 Western印迹和qRT-PCR结果表明，与人正常支气管上皮细胞HBE相比，在肺癌细胞A549组中ADAMTS18的mRNA和蛋白表达量显著下降(P<0.05)，而miR-9-5p表达量显著上升(P<0.05)，见图1和表1。

图1 检测ADAMTS18在肺癌A549细胞和人正常支气管上皮细胞HBE中的表达

表1 检测miR-9-5p和ADAMTS18在肺癌A549和支气管上皮细胞HBE中的表达

2.2抑制miR-9-5p可抑制肺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭 qRT-PCR结果表明，与anti-miR-NC组相比，anti-miR-9-5p组miR-9-5p表达量显著下降(P<0.05)。MTT实验结果表明，与anti-miR-NC组相比，anti-miR-9-5p组的细胞活性(OD490 nm)在作用48、72 h显著下降(P<0.05)。Transwell实验结果显示，与anti-miR-NC组相比，anti-miR-9-5p组A549迁移细胞数和侵袭细胞数显著下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 抑制miR-9-5p对肺癌A549细胞增殖、迁移及侵袭的影响

2.3miR-9-5p靶向调控ADAMTS18的表达 Targetscan软件预测结果显示，ADAMTS18的3′-UTR序列中含有与miR-9-5p互补的核苷酸序列，见图2。双荧光素酶报告系统结果显示，与miR-NC组相比，miR-9-5p组野生型WT-ADAMTS18的萤火虫荧光素酶相对活性显著下降(P<0.05)；而突变型MUT-ADAMTS18的萤火虫荧光素酶相对活性没有明显变化(P>0.05)。Western印迹结果表明，与miR-NC组(0.42±0.04)相比，miR-9-5p组ADAMTS18蛋白表达量(0.19±0.03)显著下降(P<0.05)；与anti-miR-NC组(0.37±0.04)相比，anti-miR-9-5p组ADAMTS18蛋白表达量(0.84±0.08)显著上升(P<0.05)，见表3和图3。

图2 ADAMTS18的3’UTR中含有与miR-9-5p互补的核苷酸序列

表3 双荧光素酶报告实验

图3 ADAMTS18蛋白表达

2.4ADAMTS18过表达抑制肺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭 Western印迹结果发现，与pcDNA组相比，pcDNA-ADAMTS18组ADAMTS18蛋白表达显著下降，见图4。qRT-PCR结果发现，与pcDNA组相比，pcDNA-ADAMTS18组ADAMTS18 mRNA表达显著上升(P<0.05)。MTT实验和Transwell实验结果显示，与pcDNA组相比，pcDNA-ADAMTS18组A549细胞活性在作用48、72 h显著降低(P<0.05)，迁移细胞数和侵袭细胞数显著下降(P<0.05)，见表4。

图4 检测肺癌A549细胞中ADAMTS18蛋白的表达

表4 过表达ADAMTS18对肺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭的影响

2.5抑制ADAMTS18表达逆转了抑制miR-9-5p对A549细胞增殖、迁移和侵袭的影响 Western印迹结果发现，与anti-miR-NC组相比，anti-miR-9-5p组ADAMTS18蛋白表达显著上升(P<0.05)，与anti-miR-9-5p+si-NC组相比，anti-miR-9-5p+si-ADAMTS18组ADAMTS18蛋白表达显著下降(P<0.05)。MTT和Transwell结果显示，与anti-miR-NC组相比，anti-miR-9-5p组A549细胞活性在作用48 h和72 h显著下降(P<0.05)，迁移和侵袭细胞数均显著下降(P<0.05)；与anti-miR-9-5p+si-NC组相比，an-ti-miR-9-5p+si-ADAMTS18组A549细胞活性在作用48 h和72 h时显著上升(P<0.05)，迁移和侵袭细胞数均显著上升(P<0.05)。见表5,图5。

表5 抑制ADAMTS18表达逆转了抑制miR-9-5p对肺癌A549细胞增殖、迁移、侵袭的作用

1～4：anti-miR-NC组、anti-miR-9-5p组、anti-miR-9-5p+si-NC组、anti-miR-9-5p+si-ADAMTS18组

3 讨 论

随着环境污染的加剧，吸烟人口的低龄化，2015年我国的肺癌新发病例数约55.8万例，且死亡病例数约49.5万例，肺癌发病率逐年上升，患者5年生存率极低〔1～4〕。研究肺癌发生、转移机制，对肺癌诊断和治疗具有指导意义。

研究表明，miRNA参与肺癌发生和发展全过程，并与肺癌的预后和耐药性有关〔5～7〕。作为一种高度保守的miRNA，miR-9-5p最早发现于神经系统，调控神经系统正常发育，近年来发现其在多种癌症中异常表达，且与癌症的发展有关〔8〕。Xie等〔9〕发现，在宫颈癌中，miR-9-5p是lncRNA NEAT1的靶向结合位点，与癌细胞的增殖迁移有关。陈伟泉等〔10〕研究表明，miR-9-5p在舌癌组织中表达量显著上调，通过靶向抑制Ambral表达进而促进舌癌细胞增殖。Barbano等〔11〕发现，在乳腺癌中，miR-9-5p表达上调，与癌细胞的转移、侵袭和患者不良预后有关，miR-9-5p的上调是表观遗传机制和雌性激素调节途径之间相互作用的结果。Yang等〔12〕研究发现，在中国云南宣威市，miR-9-5p在非小细胞肺癌患者血清中表达上调，是非小细胞肺癌诊断的潜在标志物。本研究结果表明，与人正常支气管上皮细胞HBE相比，miR-9-5p在肺癌A549细胞中显著上调，与Yang等〔12〕的研究结果一致，而抑制miR-9-5p表达可抑制A549细胞增殖、迁移和侵袭，证实了miR-9-5p在癌症发展中的作用。

ADAMTS18是含血小板结合蛋白基序的解聚素金属蛋白酶的一种，与肿瘤的血管生成和侵袭性密切相关，在多种肿瘤组织中表达异常〔13,15,20,21〕。郭丽丽等〔14〕发现，在食管鳞状细胞癌中，ADAMTS18表达量显著低于癌旁组织，与肿瘤的发生和分化程度有关。

在宫颈癌中，ADAMTS18表达下调〔16〕。Xu等〔17〕研究表明，ADAMTS18在肾透明细胞癌中表达下调，且呈高甲基化。Xu等〔18〕发现，ADAMTS18在乳腺癌中表达下调，过表达ADAMTS18可抑制癌细胞迁移和侵袭。Zhang等〔19〕发现，ADAMTS18在肺癌组织中通常呈现甲基化，过表达ADAMTS18可抑制肺癌细胞增殖、迁移和侵袭，ADAMTS18通过抑制EGFR/AKT信号传导，增强肺癌细胞对顺铂的敏感性。本研究证实，ADAMTS18在肺癌A549细胞中的表达量显著下降，过表达ADAMTS18可抑制肺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭。

此外，Targetscan软件预测结果暗示miR-9-5p与ADAMTS18之间可能存在结合位点或调控关系。通过Western印迹和双荧光素酶报告系统结果发现，miR-9-5p靶向负调控ADAMTS18的表达，抑制ADAMTS18逆转了下调miR-9-5p对A549细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。本研究证实了在非小细胞肺癌中miR-9-5p和ADAMTS18之间的调控关系。

本研究首次阐述了miR-9-5p在非小细胞肺癌A549细胞中靶向负调控ADAMTS18的表达，进而抑制A549细胞增殖、迁移和侵袭。miR-9-5p有望成为非小细胞肺癌诊断和治疗的分子生物学靶点，对肺癌的诊断和治疗提供了新的研究方向。