董倩，叶旭，廖前进，周钰娟，杨锫，杨敬儒，杨松华，朱笑丛，曾娜，师颖瑞

[1.南华大学 临床医学系，湖南 衡阳 421001；2.湖南省肿瘤医院（中南大学湘雅医学院附属肿瘤医院） 放射治疗科，湖南 长沙 410013]

我国是食管癌高发地区，其发病率居恶性肿瘤第6 位，病死率居第4 位[1]，对无法手术或拒绝手术的局部晚期食管癌患者，放疗是重要的治疗手段[2]。然而，因为部分肿瘤对放射线抵抗导致局控率降低，放疗后约40%～60%食管癌患者治疗未控或者复发[3]。原发性及获得性放疗抵抗是影响肿瘤治疗效果和患者生存预后的重要因素，因此，寻找可以预测食管鳞状细胞癌（以下简称食管鳞癌）放疗敏感性的生物标志物有重要意义。本研究应用免疫组织化学法检测食管鳞癌组织中Cdc25C 的表达情况，并分析Cdc25C 表达在食管鳞癌预后判断及临床疗效监测中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2011月1月—2016年12月湖南省肿瘤医院确诊的食管鳞癌患者，最终纳入50 例进行回顾性研究（实验组）。其中，男性40 例，女性10 例；年龄32 ～70 岁（中位年龄61 岁）；颈段6 例，胸上段18 例，胸中下段26 例；高分化鳞癌9 例，中分化鳞癌19 例，低分化鳞癌22 例；临床分期采用2009年美国癌症联合会（AJCC）第7 版食管鳞癌的分期标准[4]，Ⅱ期18 例，Ⅲ期32 例；根据增强胸部CT 和其他检查结果，诊断淋巴结转移者35 例，无淋巴结转移者15 例。所有患者行根治性放射治疗，放疗方式为三维适形放疗或调强放射治疗，计划肿瘤靶区（PGTV）为60 ～64 Gy/30-33 F。本研究同时选取20 例食管鳞癌旁正常组织作为对照组。

1.2 主要试剂和方法

兔单克隆抗体抗Cdc25C[E302]购自美国Abcam公司，免疫组织化学染色采用SP 法，兔/鼠通用型SP试剂盒购自江苏康为世纪生物科技有限公司，食管鳞癌组织及食管鳞癌旁正常组织均由湖南省肿瘤医院病理科提供。免疫组织化学所有操作步骤均按试剂盒说明书进行，一抗的工作浓度为1 ∶300。用PBS 代替一抗做空白对照。

1.3 免疫组织化学结果判定

表达结果按照染色强度和染色范围综合计分。染色强度分为4 级： 不显色为0 分；浅黄色为1 分；棕黄色为2 分；棕褐色为3 分。染色范围（高背景下的阳性细胞所占百分比）分为4 级： 无阳性细胞计为0 分；阳性细胞1%～20%为1 分；＞20%～75%为2 分；＞75%为3 分。两分级相乘，≤4 分定义为Cdc25C 低表达，＞4 分定义为Cdc25C 高表达。

1.4 评价标准

放疗结束后1 ～3 个月复查食管钡餐进行近期疗效评价。近期疗效评价采用万均教授食管癌放疗后疗效评价标准[5]。完全缓解（complete response, CR）即肿瘤病灶完全消失，食管边缘光滑，钡剂通过顺利，管壁可稍显强直，管腔无明显狭窄或稍显狭窄，黏膜基本恢复正常或增厚；部分缓解（partial response,PR）即病变大部分消失，无明显扭曲或成角畸影，无向腔外溃疡，钡剂通过尚顺利，且边缘欠光滑，有小的充盈缺损或/和小龛影，或边缘虽光滑，但管腔有明显狭窄；无缓解（no response, NR）即放疗结束时，病变看不出明显好转，或充盈缺损及龛影或狭窄加重。

1.5 随访

所有随访信息均来自病例系统及电话随访，随访内容包括食管钡餐以及总生存期（overall survival,OS）。随访时间自治疗结束后1 个月后开始计算，截止到2018年10月31日。OS 是指从疾病确诊的日期到死亡日期或者随访截止日期的时间，本研究的随访终点为OS。

1.6 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0 统计软件。计数资料以例（%）表示，比较采用χ²检验；Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，比较用Log-rank χ²检验；影响因素分析用多因素Cox 风险回归模型，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Cdc25C 在食管鳞癌组织和癌旁正常组织中的表达情况

Cdc25C 阳性染色主要定位在细胞核中，呈黄棕色或棕褐色颗粒，背景不着色。对照组Cdc25C 表达水平较低，呈现低表达，实验组Cdc25C 表达水平上调。Cdc25C 在实验组中高表达58%（29/50），在对照组中低表达0%（0/20）。见图1。

图1 Cdc25C 在食管鳞癌及癌旁组织中的表达情况 （SP 法×400）

2.2 Cdc25C 表达水平与患者临床特征的关系

Cdc25C 表达水平与食管鳞癌患者的性别、年龄、部位、T 分期及分化程度无关（P＞0.05），但与临床分期及淋巴结转移相关（P＜0.05），淋巴结转移率越高、临床分期越晚，其在食管鳞癌组织中的表达越强。见表1。

表1 食管鳞癌患者Cdc25C 表达阳性率的比较

2.3 近期疗效

Cdc25C 高表达组29 例，其中CR 7 例，PR 20 例，NR 2 例；Cdc25C 低表达组21 例，其中CR 14 例，PR 7 例，NR 0 例。将Cdc25C 表达水平和食管鳞癌患者近期疗效采用χ2检验进行关联性检验，差异有统计学意义（χ2=9.557，P=0.008），Cdc25C 高表达组近期疗效较差。

2.4 生存分析

实验组1、2 及3年总生存率为82%、56%和24%，中位生存时间是24.5 个月；Cdc25C 高低表达两组1、2 及3年总生存率分别为72%、45%、10%和90%、67%、48%。Cdc25C 高表达组生存率低于低表达组（χ2=6.846，P=0.009）。见图2。

图2 Cdc25C 高表达组与低表达组的生存曲线

2.5 影响食管鳞癌患者预后的因素

对患者性别、年龄、肿瘤部位、淋巴结是否转移、临床分期、分化程度、Cdc25C 表达水平进行单因素分析，结果显示Cdc25C 高表达、临床分期与食管鳞癌不良预后相关（P＜0.05）。将单因素分析有统计学意义的因素纳入多因素Cox 风险回归模型，结果表明Cdc25C 在食管鳞癌组织中表达水平是食管鳞癌患者预后的独立因素[=0.399（95% CI： 0.176，0.906），P=0.028]。见表2、3。

表2 食管鳞癌患者单因素预后分析

表3 食管鳞癌患者多因素预后分析参数

3 讨论

食管癌发病率高，预后差，严重威胁人类的生命安全。早期食管癌首选手术切除已成为共识，并且疗效确切，但对局部晚期食管癌单纯手术切除5年生存率仍较低，而大多数患者就诊时已处中晚期[6-7]，同步放化疗是非手术局部晚期食管癌标准治疗模式[8]。在我国，鳞癌是食管癌的主要病理类型，约占90%，鳞癌对放疗中度敏感，单纯放疗时5年生存率仅10%～15%[9-10]。然而，食管鳞癌细胞存在放射敏感性差异，增加放射治疗的剂量并不一定能改善5年生存率或无病生存[11]，因此，放疗之前或者放疗期间准确预测食管癌的放疗敏感性，采取合理的个体化治疗方案，寻找可以预测食管癌放疗疗效的生物标志物显得尤为重要。

近年来，与食管癌放疗敏感性有关的分子标志物陆续报道，目前报道较多的有抑癌基因P53、细胞周期调控子（Cdc25C、Cyclin D1）、DNA 损伤修复相关因子、凋亡相关因子（HDAC1、端粒酶）等[12]，其中Cdc25C 是细胞分裂磷酸化酶25 家族中的一员，参与真核细胞有丝分裂周期的调控，在正常的细胞周期中具有重要作用，若其表达异常，将会导致细胞周期紊乱、失常，从而发生肿瘤[13]。已有众多研究显示，Cdc25C 是一种肿瘤相关抗原[14]，在对肝癌、结肠癌、胃癌、前列腺癌等研究中发现Cdc25C 的表达较正常组织升高，提示Cdc25C 在肿瘤发生、发展过程中起重要作用[15]。

目前，关于Cdc25C 影响食管癌细胞放疗敏感性机制可能有多种，但具体机制仍不清楚。放疗主要是电离辐射通过直接作用或间接作用导致细胞DNA 的损伤，从而引起细胞死亡[16]。放疗效果不佳主要有两方面的原因： ①细胞本身原因或其肿瘤细胞微环境保护从而导致细胞对射线不敏感；②电离辐射后DNA损伤修复；后者是主要因素[17]。在细胞修复的过程中，细胞周期检验点蛋白表达水平的差异在DNA 损伤修复方面具有举足轻重的作用[18]，肿瘤细胞的高DNA损伤修复能力将导致对放射线的抵抗。有文献报道，肿瘤细胞受到辐射损伤后产生的DNA 双链断裂主要通过激活ATM-Chk2-Cdc25C 通路修复，此通路可引起G2/M 期停滞，使肿瘤细胞有足够的时间修复损伤的DNA[19]。在正常细胞周期中，Cdc25C 对细胞周期的调控是通过活化Cyclin B/-Cdc2 复合物使细胞由G2 期进入到M 期来调控的[11-12]。在分裂间期Cdc2 上的Tyr15和Thr14 存在抑制性磷酸化，该磷酸化状态使Cyclin B/-Cdc2 复合物失活，使细胞无法分裂，而Cdc25C 则可使Tyr15 和Thr14 去磷酸化后活化，进而使细胞分裂[20]。Cdc25C 作为ATM-Chk2-Cdc25C 信号通路的下游底物，是G2/M 期检查点的重要效应因子[21]。在细胞受到辐射损伤后，检查点感受器ATM 感知DNA 损伤并活化，继而磷酸化其下游底物Chk2，被磷酸化后的Chk2 使Cdc25C 上丝氨酸第216 位残基发生抑制性磷酸化[22-23]，从而失去使Cdc2 去磷酸化后活化的能力，分裂进程因此被抑制，受损的细胞被阻滞在G2 期而获得足够的时间进行修复，从而增加肿瘤细胞对放射线的抵抗性[24]。

在前期研究中，构建食管癌放疗抵抗细胞（TE13-R），并发现Cdc25C 蛋白在TE13-R 细胞中表达上调，当利用Cdc25C干扰质粒转染TE13-R细胞后，可抑制Cdc25C 蛋白的表达，同时癌细胞放射抵抗消失。其结果提示Cdc25C 的表达与食管癌的放疗抵抗密切相关，Cdc25C 的高表达可能增强食管癌对放射线的抗拒，Cdc25C 可能是食管癌放疗敏感性相关基因。因此，为进一步明确Cdc25C 与食管癌放疗抵抗的关系，本文收集临床病例资料，采用免疫组织化学法检测Cdc25C 在食管鳞癌组织中的表达情况，结果显示Cdc25C 在食管鳞癌中高表达且与患者预后不良有关。

综上所述，Cdc25C 表达水平可能与食管鳞状细胞癌放疗抵抗相关，Cdc25C 有望作为食管鳞癌放射治疗中的潜在判断预后的分子标志物，并可能具有预后判断、监测临床疗效的作用。但因本研究病例数较少，仍需开展大规模的临床试验及相关的细胞分子实验加以证实。