张正卫，杨一君

（南京医科大学附属淮安第一医院 1.病理科，2.妇产科，江苏 淮安 223001）

结直肠癌是目前世界上常见的恶性肿瘤之一，每年约有120 万新发病例，同时约有60 万患者死于该病[1]。及时诊断和治疗虽然降低了结直肠癌患者的病死率，但是患者的5年生存率仍然停留在60%～70%[2]，一大部分结直肠癌患者被确诊时已经处于进展期，局部侵袭和远处转移是结直肠癌患者死亡的重要原因，因此预防和缓解结直肠癌的进展和转移对改善患者的预后意义重大。

长链非编码RNA（long non-coding RNAs, lncRNA）属于长度＞200 个核苷酸的非编码RNA，越来越多的研究报道lncRNAs 与细胞凋亡、增殖、迁移、侵袭等密切相关，在肿瘤发生、发展中的作用也愈发受到关注[3-5]，LncRNA 在多种类型肿瘤中异常表达，通过多种途径影响肿瘤进展和转移[6-8]。lncRNA HSALNT0000015 是一个编码289 个核苷酸的lncRNA，本研究通过检测lncRNA HSALNT0000015 在结直肠癌组织和人结直肠癌细胞中的表达，分析其对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响，探讨lncRNA HSALNT0000015 与结直肠癌进展、转移及预后的关系。

1 材料与方法

1.1 实验材料

DMEM 培养基和胎牛血清（FBS）购自美国Gibco公司，人结直肠癌细胞Lovo、SW480、HT-29、HCT 116 和正常人肠黏膜上皮细胞HIEC 购自上海中国科学院细胞库，敲减lncRNA HSALNT0000015 的质粒和空载质粒购自上海吉凯生物有限公司，Lipofectamine 2000脂质体、MTT 试剂盒和实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）试剂盒和引物购自上海生工生物工程股份有限公司，Transwell 小室和Matrige 基质购自美国Corning 公司，抗转录因子Slug、上皮钙黏素（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）及GAPDH 抗体购自美国CST 公司，生存期结肠癌cDNAHColA095Su02 芯片购自上海芯超生物有限公司，手术标本取自南京医科大学附属淮安第一医院结直肠癌患者，包括癌组织80 例，癌旁组织15 例。手术时间2006年2月—2010年2月，随访时间截至2015年9月。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养和转染人结直肠癌细胞Lovo、SW480、HT-29、HCT116 和正常人肠黏膜上皮细胞HIEC 培养于含5% FBS 的DMEM 培养基，置于5%二氧化碳、37℃培养箱中培养，由于结直肠癌细胞系HCT116 中lncRNA HSALNT0000015 表达最高，选取对数生长期的HCT116 细胞进行转染，参照转染说明书进行操作，将HCT116 细胞以2×105个/孔接种于6 孔板，当融合度达50%～60%时，分别将空白对照、阴性对照质粒、siRNA 转染HCT116 细胞设为空白组、对照组及实验组，继续培养12 h 后更换培养基。

1.2.2 qRT-PCR 检测lncRNA HSALNT0000015 水平使用Trizol 试剂提取细胞RNA，将RNA 逆转录为cDNA 后进行检测，以GAPDH 为内参，检测lncRNA HSALNT0000015 相对表达水平，lncRNA HSALNT00 00015 表达量取中位数，高于中位数定义为lncRNA HSALNT0000015 高表达，低于中位数定义为lncRNA HSALNT0000015 低表达。qRT-PCR反应体系为： cDNA 模板2 μl，正、反向引物各1 μl，10×混合试剂2 μl，双蒸水15 μl，反应条件为94℃预变性3 min，94℃变性30 s、55℃退火30 s、72℃ 延伸30 s，共30 个循环。见表1。

1.2.3 MTT 法检测细胞增殖能力取转染后状态良好的空白组、对照组及实验组HCT116 细胞，消化收集细胞后将密度调整为0.5×104个/ml，以3×103个/孔接种于96 孔板。使用MTT 试剂盒检测细胞的增殖能力，每孔加入MTT 溶液10 μl，继续培养4 h，酶标仪检测490 nm 波长处的光密度（OD）值，检测第0、12、24、36 及72 小时的细胞增殖能力。实验重复5 次。

1.2.4 Transwell 迁移/侵袭实验检测细胞迁移/侵袭能力取转染后状态良好的空白组、对照组及实验组HCT116 细胞，消化收集细胞，使用无血清培养基调整细胞密度为2×104个/ml，以0.4×103个/孔加入Transwell 小室，在下室中加入10% FBS 的500 μl 培养基，继续培养12 h 后，使用甲醇固定，0.2%结晶紫染色，倒置显微镜下观察，取4 个视野（100 倍）计数，实验重复4 次。侵袭实验： 在迁移实验的基础上在上室铺Matrige 基质，其余操作同迁移实验。

表1 qRT-PCR 引物及siRNA 寡核苷酸序列

1.2.5 免疫印迹法检测细胞迁移相关蛋白表达水平取转染后状态良好的空白组、对照组及实验组HCT116细胞，提取蛋白后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE），一抗孵育过夜，二抗孵育1 h 后显影。GAPDH为内参，检测E-cadherin、Slug 和Vimentin 蛋白。实验重复4 次。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示。比较采用成组t检验、单因素方差分析或重复测量设计的方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验；计数资料以例表示，比较用χ2检验；生存分析采用Kaplan-Meier 生存曲线，组间比较采用Log-rank χ2检验；多因素分析采用Cox 回归模型，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结直肠癌组织和癌旁组织中lncRNA HSALNT0000015 的表达及与临床病理特征的关系

lncRNA HSALNT0000015 在结直肠癌组织中相对表达量（6.890±0.180）与癌旁组织（2.127±0.242）比较，差异有统计学意义（t=11.062，P=0.000）；结直肠癌组织中lncRNA HSALNT0000015 高、低表达的淋巴结转移和临床分期比较，差异有统计学意义（P＜0.05），表达越高，肿瘤越趋于淋巴结转移，临床分期越高；而年龄、性别及T 分期比较，差异无统计学意义（均P＞0.05）。见表2。

2.2 肿瘤组织中lncRNA HSALNT0000015 的表达与结直肠癌患者预后的关系

结直肠癌患者术后随访5 ～9年，死亡43 例，生存分析结果显示，在Ⅰ、Ⅱ期（42 例）、Ⅲ、Ⅳ期（38 例）和Ⅰ～Ⅳ期（80 例）的结直肠癌患者中，lncRNA HSALNT0000015 高表达患者的总体生存率均低于lncRNA HSALNT0000015 低表达患者（χ2=60.241、14.820 和65.232，均P=0.000）。多因素Cox回归分析结果表明，结直肠癌组织中lncRNA HSALNT 0000015 高表达是结直肠癌患者预后不良的危险因素[=16.289（95% CI： 6.950，38.179），P=0.000]。见图1和表3、4。

2.3 空白组、对照组及实验组细胞增殖能力比较

结直肠癌细胞Lovo、SW480、HT-29、HCT116中lncRNA HSALNT0000015 表达高于正常人肠黏膜上皮细胞HIEC（F=153.942，P=0.000），选择HCT116细胞作为实验细胞敲减lncRNA HSALNT0000015 的表达（见图2A）。由于si-1 敲减效率最高（F=40.760，P=0.000），因此选择si-1 作为实验组细胞（见图2B）。第0、12、24、48 和72 小时，空白组HCT116细胞的OD 值分别为（0.221±0.011）、（0.423±0.032）、（0.615±0.041）、（1.021±0.092）和（1.434±0.124），对照组HCT116 细胞的OD 值分别为（0.223±0.022）、（0.434±0.042）、（0.652±0.033）、（0.963±0.122）、（1.432±0.114），实验组HCT116 细胞的OD 值分别为（0.201±0.032）、（0.184±0.022）、（0.291±0.062）、（0.383±0.032）、（0.501±0.042）。3 组不同时间点OD 值比较，采用重复测量设计的方差分析，结果： ①不同时间点OD 值有差异（F=589.198，P=0.001）；②组间OD 值比较有差异（F=790.000，P=0.001），实验组低于空白组和对照组；③3 组OD 值变化趋势有差异（F=168.913，P=0.000）。见图2C。

表2 结直肠癌组织中lncRNA HSALNT0000015 表达与临床病理特征的关系 例

图1 lncRNA HSALNT0000015 不同表达水平结直肠癌患者的Kaplan-Meier 生存曲线

表3 结直肠癌患者预后因素的单因素分析参数

表4 结直肠癌患者预后因素的多因素分析参数

图2 敲减HSALNT0000015 后抑制HCT116 细胞的增殖能力

2.4 空白组、对照组及实验组细胞迁移和侵袭能力比较

迁移实验中，HCT116 细胞穿膜细胞数，实验组为（40.442±7.481）个/视野、空白组为（133.812±7.473）个/ 视野、对照组为（132.442±8.623）个/ 视野，3 组比较，差异有统计学意义（F=737.991，P=0.000）。侵袭实验中，HCT116 细胞穿膜细胞数，实验组为（18.562±2.941）个/视野、空白组为（55.942±7.683）个/视野和对照组为（54.313±7.684）个/视野，3 组比较，差异有统计学意义（F=191.223，P=0.000）。见图3。

2.5 空白组、对照组及实验组细胞转移相关蛋白比较

3 组E-cadherin、Slug 和Vimentin 蛋白相对表达量比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。实验组HCT116 细胞E-cadherin 蛋白相对表达量高于空白组和对照组（P＜0.05），而Slug 和Vimentin 蛋白相对表达量低于空白组和对照组（P＜0.05）。见表5和图4。

图3 敲减HSALNT0000015 后抑制HCT116 细胞迁移和侵袭能力 （×100）

表5 3 组Slug、E-cadherin 和Vimentin 蛋白相对表达量的比较 （±s）

表5 3 组Slug、E-cadherin 和Vimentin 蛋白相对表达量的比较 （±s）

组别 Slug E-cadherin Vimentin空白组 0.693±0.035 0.550±0.030 0.997±0.180对照组 0.600±0.062 0.427±0.031 0.897±0.045实验组 0.267±0.055 1.377±0.172 0.260±0.046 F 值 55.445 76.812 39.514 P 值 0.000 0.000 0.000

图4 在HCT116 细胞中敲减lncRNA HSALNT0000015后对相关蛋白的影响

3 讨论

lncRNA 可以作为miRNA 海绵结合并调控miRNA的功能，除此之外，lncRNA 也可以与蛋白质相互作用增强或削弱其功能[4]，lncRNA 在肿瘤早期诊断和治疗方面的潜力越来越受到关注[9-11]，lncRNA 可能在肿瘤的发生、发展过程中起到重要作用。许多lncRNA 如LINC01354、CPS1-IT1、RP11 在结直肠癌组织中异常高表达或低表达，发挥促癌作用或抑癌作用[6，12-13]。HSALNT0000015 是一种新发现的尚不清楚功能的lncRNA。

本研究结果表明，lncRNA HSALNT0000015 在结直肠癌组织和结直肠癌细胞中的表达水平高于癌旁组织和正常人肠上皮细胞，且随着TNM 分期越高相对表达更高；此外，lncRNA HSALNT0000015 在有淋巴结转移结直肠癌组织中较无淋巴结转移结直肠癌组织中相对表达更高。敲减结直肠癌HCT116 细胞中lncRNA HSALNT0000015 的表达水平后，细胞增殖、迁移和侵袭能力均被抑制，以上结果提示lncRNA HSALNT0000015 可能参与调控结直肠癌的进展和转移。

上皮间质转化过程将上皮细胞重新编程使其具有间充质表型，是增强肿瘤细胞侵袭和转移的关键步骤[14]。已有许多研究报道lncRNA 通过上皮间质转化过程促进结直肠癌迁移和侵袭[15-17]，上皮间质转化过程由一系列转录因子介导，如Slug、Snail、Twist和Zed1/2 等，转录因子可以抑制E-cadherin 并诱导间充质标志物如N 型钙黏蛋白、Vimentin 和纤连蛋白的表达[18-20]。本研究敲减结直肠癌细胞HCT116 细胞中lncRNA HSALNT0000015 的表达后，转化因子Slug 和Vimentin 表达下调，E-cadherin 表达上升，表明lncRNA HSALNT0000015 可能是通过上皮间质转化过程促进结直肠癌细胞的迁移和侵袭。

生存分析发现，lncRNA HSALNT0000015 与结直肠癌患者的不良预后呈正相关，Cox 回归分析结果显示，肿瘤组织中lncRNA HSALNT0000015 的异常高表达是结直肠癌患者总体生存时间的危险因素，以上结果表明lncRNA HSALNT0000015 可以作为判断结直肠癌患者的不良预后标志物。

综上所述，HSALNT0000015 在结直肠癌组织和细胞中异常高表达，且其高表达可能与肿瘤增殖、淋巴结转移、TNM 分期相关，敲减lncRNA HSALNT0000015 的表达可以抑制结直肠癌细胞系HCT116 的增殖、迁移和侵袭能力，其作用机制可能为lncRNA HSALNT0000015 通过上皮间质转化过程促进结直肠癌细胞的迁移和侵袭，lncRNA HSALNT0000015 可能会为结直肠癌患者预后判断和治疗提供新的方向。