何翠，陈春丽，柯青，沈力，邓鑫州，顾兵，孙蕊格，段奇文

0 引言

食管癌是消化系统常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率一直居高不下。放射治疗是食管癌的重要治疗方式，不仅能提高手术切除率，而且在控制局部复发方面也发挥重要的作用，但放射抗拒是导致放疗失败的主要原因[1]。DLK1是表皮生长因子家族成员之一，它参与多种细胞的增殖、分化，并且与肿瘤的发生发展有着密切的关系[2]，但目前尚未有关于DLK1与食管癌放射抵抗的研究。本研究主要是通过合成DLK1 siRNA，转染前期构建的放射抗拒食管癌细胞KYSE-R，观察DLK1干扰后对食管癌放射抗拒细胞的放射敏感度影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

DMEM培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司；DLK1抗体、GAPDH抗体、HRP-标记二抗购自美国Abcam公司，DLK1 siRNA干扰序列和阴性对照序列均由上海吉玛公司合成。蛋白裂解液、蛋白提取试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、细胞周期检测试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒均购自上海碧云天生物技术研究所；RNA反转录试剂盒、PCR扩增试剂盒购自日本TaKaRa公司；Lipofectamine 3000购自美国Invitrogen公司；流式细胞仪购自美国BD公司；荧光定量PCR仪、凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司；相机购自日本Canon公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养KYSE、KYSE-R细胞，并置于37℃、饱和湿度、5%CO2的细胞培养箱中，待贴壁生长至80%时进行胰酶消化传代。

1.2.2 放射抗拒食管癌KYSE-R细胞的构建 选取对数生长期的KYSE细胞接种于10 cm塑料培养皿内（细胞数1×106个/皿），培养皿内均加入8 ml含10%胎牛血清的DMEM培养液，置于恒温箱中培养24 h后，接受2 Gy剂量的X线重复照射（放疗设备Varian Unique，照射能量6 MV，照射野15 cm×15 cm，照射距离100 cm，剂量率2 Gy/min），每次照射后放回恒温箱中继续培养，累积照射28次，即当总剂量达到56 Gy时，对存活的细胞进行单克隆，稳定传代后得到放射抗拒KYSE-R细胞株。

1.2.3 细胞克隆形成实验 收集对数生长期的KYSE和KYSE-R细胞，选取恰当的细胞数接种于6孔培养板内：0 Gy（400个/孔）、2 Gy（800个/孔）、4 Gy（1 600个/孔）、6 Gy（3 200个/孔）、8 Gy（6 400个/孔）、10 Gy（12 800个/孔）。采用X线对细胞进行体外照射，照射结束后，继续培养12天，取出培养板，移去培养液，PBS洗两次，甲醇固定15 min。移去固定液，0.1%结晶紫染色。显微镜下计数大于50个细胞的集落数，并计算存活分数。存活分数为纵坐标，照射剂量为横坐标，绘制剂量存活曲线。实验重复3次。

1.2.4 RT-PCR实验 收集对数生长期的KYSE和KYSE-R细胞裂解后，按照RNA反转录试剂盒说明书操作提取RNA，并进行反转录合成cDNA，然后进行PCR反应，PCR反应条件：95℃预变性1 min，95℃变性15 s，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，40个循环。DLK1引物序列：F:5′-CAAAATGGATTCTGCGAGGAT-3′，R:5′-CCCGAACATCTCTATCACAGA-3′；GAPDH引物序列：F:5′-CCAACCGCGAGAAGATGA-3′，R:5′-CCAGAGGCGTACAGGGATAG-3′。以GAPDH为内参，按照2-ΔΔCt法计算DLK1相对表达量。

1.2.5 Western blot实验 分别收集对数生长期的KYSE和KYSE-R细胞，PBS洗涤2次，加入裂解缓冲液置冰上裂解30 min,4℃，12 000 r/min离心10 min，收集上清液，采用BCA法检测各样本蛋白含量。各组取50 μg样品上样行10%SDS-PAGE电泳（80 V恒压30 min，120 V恒压50 min），将蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入一抗（DLK1:1:500、GADPH:1:1 000），置4℃冰箱过夜，次日TBST洗涤5 min×3次,加羊抗兔Ig G-HRP（1:1 000）、羊抗鼠Ig G-HRP（1:1 000）室温孵育2 h，TBST洗涤5 min×3次，ECL化学发光法试剂盒显影。

1.2.6 DLK1 siRNA转染 吉玛公司合成的三条siDLK1干扰序列为：siDLK-1:F:5′-GGACGAUGGCCUCUAUGAATT-3′，R:5′-UUCAUAGAGGCCAUCGUCCTT-3′；siDLK-2:F:5′-CCUGAAGGUGUCCAUGAAATT-3′，R:5′-UUUCAUGGACACCUUCAGGTT-3′；siDLK-3:F:5′-GCACUGUGGGUAUCGUCUUTT-3′，R:5′-AAGACGAUACCCACAGUGCTT-3′；阴性对照（Negative control,NC）序列为：F:5′-UUCUCCGAACGUACGUTT-3′，R:5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。收集对数生长期的KYSE-R细胞，调整细胞密度为2×105个/毫升接种于6孔板，按照Lipofectamine 3000说明书操作转染siDLK1和Negative control，收集转染48、72 h后的细胞进行后续实验。

1.2.7 细胞凋亡检测 KYSE-R细胞经DLK siRNA转染后，采用4 Gy X射线照射细胞，24 h后离心收集细胞（约1×106个），预冷PBS洗3次。按照细胞凋亡检测试剂盒说明书操作，采用Annexin V/PI双染，流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.8 细胞周期检测 KYSE-R细胞经DLK siRNA转染，采用4 Gy X线照射后，收集细胞（约1×106个），预冷PBS洗3次。70%的冷乙醇4℃固定过夜。按照细胞周期检测试剂盒说明书操作染色，采用流式细胞仪检测细胞周期。

1.3 统计学方法

使用SPSS22.0软件分析数据。以上所有实验至少重复三次，数据结果以表示，通过配对样本t检验进行计算分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KYSE-R细胞放射敏感度检测

我们前期通过X线反复照射及培养获得了放射抗拒食管癌细胞KYSE-R，并通过细胞克隆形成实验对其放射敏感度进行检测，结果显示：与KYSE细胞相比，KYSE-R细胞表现出显著的放射抗拒性，差异有统计学意义（P=0.021），见图1。

图1 KYSE与KYSE-R照射后细胞存活曲线Figure 1 Survival curves of KYSE and KYSE-R cells after irradiation

2.2 DLK1在KYSE和KYSE-R中细胞的表达

RT-PCR检测结果显示：KYSE、KYSE-R细胞中DLK1 mRNA相对表达量分别为1.002±0.011、1.795±0.068，差异有统计学意义（P=0.032），见图2A；Western blot检测结果显示：KYSE-R细胞中DLK1蛋白表达水平显著高于KYSE细胞，见图2B。

2.3 DLK1干扰效果验证

RT-PCR检测结果显示：Blank组、NC组、siDLK1-1组、siDLK1-2组、siDLK1-3组mRNA相对表达量分别为1.038±0.029、1.035±0.018、0.712±0.039，0.446±0.037、0.218±0.01，差异有统计学意义（与空白对照组相比，Psi-1=0.038,Psi-2=0.022,Psi-3=0.001），见图3A；Western blot检测DLK1蛋白表达，结果显示：siDLK1-3显著抑制了DLK1蛋白水平的表达，沉默效果最佳，见图3B。因此，我们选择siDLK1-3进行后续功能实验。

2.4 干扰DLK1对KYSE-R细胞放射敏感度的影响

图2 RT-PCR(A)和Western blot(B)检测DLK1在KYSE和KYSE-R细胞中的表达Figure 2 DLK1 expression in KYSE and KYSE-R cells detected by RT-PCR(A) and Western blot(B)

图3 RT-PCR(A)和Western blot(B)检测siDLK1的干扰效果Figure 3 Interference effects of siDLK1 detected by RTPCR(A) and Western blot(B)

克隆形成实验结果显示，干扰DLK1后，经4 Gy射线照射，siDLK1组细胞克隆形成能力显著低于Blank组与NC组（PBlank=0.026,PNC=0.017），提示DLK1干扰后增强了KYSE-R细胞的放射敏感度，见图4。

2.5 干扰DLK1对KYSE-R细胞凋亡的影响

流式细胞术检测结果显示：经4 Gy射线照射，Blank组、NC组和siDLK1干扰组细胞凋亡率分别为（8.037±0.822）%、（9.49±0.573）%和（22.6±1.77）%，siDLK1干扰组的细胞凋亡率显著高于Blank组和NC组，差异有统计学意义（PBlank=0.001,PNC=0.002），见图5。表明干扰DLK1增强了射线诱导的细胞凋亡。

图4 克隆形成实验检测照射后各组细胞存活情况Figure 4 Cell survival of each group detected by cloning formation assay after irradiation

2.6 干扰DLK1对KYSE-R细胞周期的影响

经4 Gy 射线照射后，Blank 组、NC 组、siDLK1干扰组G2/M细胞所占比例分别为（15.7±1.743）%、（17.38±0.682）%、（34.81±1.574）%，siDLK1干扰组G2/M细胞比例显著高于Blank组和NC组，差异有统计学意义（PBlank=0.003,PNC=0.002），见图6。表明干扰DLK1可诱导射线引起的G2/M期阻滞。

图5 流式细胞术检测各组照射后细胞凋亡Figure 5 Cell apoptosis of each group detected by flow cytometry after irradiation

图6 流式细胞术检测各组照射后细胞周期Figure 6 Cell cycle of each group detected by flow cytometry after irradiation

3 讨论

放射治疗效果取决于肿瘤对放射线的敏感程度。目前国内外调控食管癌放射敏感度的分子研究，如X线修复交叉互补基因（XRCC）[3]、Cox酶[4]、信号转导与转录激活因子3（STAT3）[5]、组蛋白去乙酰化酶1[6]等使人们对食管癌放疗抵抗的分子机制有了深入了解。DLK1是位于人类染色体14q32上,具有跨膜和分泌功能的蛋白[7]，参与多种肿瘤的发生发展，DLK1可通过调节Wnt/β-catenin信号转导途经抑制胶质瘤的生长[8]，可通过NOTCH途径抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖和侵袭[9]。这些研究加深了我们对DLK1在肿瘤发生发展过程中的作用的理解，但是其在食管癌放射抗拒中的作用还不清楚。本研究发现放射抗拒食管癌细胞KYSE-R中DLK1的表达明显上调，提示DLK1可能与食管癌的放射敏感度密切相关。

在放射治疗中，射线通过引起DNA双链断裂诱导细胞凋亡达到治疗目的，因此细胞凋亡可能是放射增敏的重要环节，王亚飞等[10]研究显示通过上调miRNA-145表达，能够抑制A549细胞增殖，促进细胞凋亡，增强放射敏感度。金德蕙等[11]研究证实干扰BAG-1基因表达，可通过增加细胞凋亡提高黑色素瘤B16F10细胞对X线的敏感度，Shen等[12]研究发现通过下调UBE2T，可显著抑制骨肉瘤细胞的克隆形成，促进细胞凋亡，从而增强放射敏感度，Li等[13]研究通过敲除整合素β1抑制下游的FAK/cortactin途径抑制喉癌细胞增殖，增强放射敏感度，这些研究均证明通过增加细胞凋亡和抑制细胞增殖能明显增强放疗的敏感度，本研究证实，下调食管癌细胞KYSE-R中DLK1的表达，经X线照射后，细胞凋亡率明显增加，增殖能力明显下降，表现出对放射线更加敏感。

细胞周期分布与肿瘤细胞的放射敏感密切相关，Shetake等[14]研究发现，氧化铁纳米颗粒诱导人纤维肉瘤细胞G2/M期阻滞，增强人纤维肉瘤细胞的放射敏感度，Adeberg等[15]研究显示，二甲双胍可以诱导胶质母细胞瘤细胞系LN18细胞的G2/M期阻滞，从而提高放射敏感度，同样，我们的研究证实，抑制DLK1的表达，经X线照射后，G2/M期细胞分布增加。因此抑制DLK1的表达，可诱导放射抗拒食管癌细胞照射后引起的G2/M期细胞阻滞，从而增强放射敏感度。

综上所述，本研究初步证实了DLK1在食管癌细胞放射抗拒中的作用，但仍有一些问题需要进一步阐明，如DLK1介导食管癌细胞放射抗拒的具体分子机制，以及本研究目前仅在一株食管癌细胞中进行了验证，在今后的研究中我们将会建立多种食管癌放射抗拒细胞株，提供更为充分的实验室证据。