刘丹奇 任发政 侯彩云

摘要：目的：研究和对比白茶、绿茶和红茶粗制多糖（crude tea polysaccharides，CTPs）的降血糖效果及机理。方法：分别选取寿眉、龙井、白琳工夫作为白茶、绿茶和红茶的代表，制备粗多糖。以链脲佐菌素诱导小鼠糖尿病模型，二甲双胍作为阳性对照，研究粗制茶多糖对小鼠体重、空腹血糖、胰岛素抵抗指数、葡萄糖耐量和胰腺组织病变情况的影响，qPCR测定小鼠肝脏中相关基因表达水平。结果：CTPs均具有降血糖功效，白茶、绿茶、红茶多糖的空腹血糖下降率分别为470%、478%、367%;CTPs均可改善小鼠葡萄糖耐量，下调Foxo1、G6Pc、PEPCK和TXNIP基因的表达量。结论：本实验剂量条件下，研究所选粗制茶多糖提取物均具有降血糖效果，其中绿茶多糖作用最明显。

关键词：茶多糖;降血糖;糖代谢

糖尿病常用治疗药物有多种毒副作用[12]，因此寻求天然植物来源的安全功效成分十分必要。茶多糖是茶叶中存在的一类具有多种生物活性的多糖复合物，多为与蛋白质结合的酸性糖蛋白[3]。Zhou等[4]研究发现，茶多糖可能是粗老茶治疗糖尿病的主要药理成分。也有研究表明，茶多酚和茶色素等成分均具有降血糖效果[57]。刘安军等[8]研究发现，茶多酚可以作为茶多糖的协同因子，共同发挥降血糖作用，效果優于茶多糖单独干预组。本实验室前期研究中也发现，白茶寿眉粗多糖提取物的降血糖效果优于多糖含量相对更高的黄大茶粗多糖提取物，茶多糖的含量与降血糖效果未呈正相关规律。近年来研究表明，茶叶种类对茶多糖的降血糖活性会产生影响[9]，但相关研究较少，对于白茶茶多糖缺少深入研究和对比。本研究在实验室前期基础上，以寿眉白茶多糖作为研究对象，选取龙井绿茶多糖及白琳工夫红茶多糖作为对照，旨在研究不同种类茶叶多糖降血糖效果的差异性，并进一步探究其具体作用机制。

1材料与方法

11材料、试剂与实验动物

白茶寿眉、绿茶龙井、红茶白琳工夫，购于北京马连道茶城。链脲佐菌素（streptozotocin，STZ），美国Sigma公司;盐酸二甲双胍片，中美上海施贵宝制药有限公司;异丙醇、氯仿、无水乙醇等（分析纯），北京化工厂;考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒，南京建成生物工程研究所;小鼠胰岛素测定试剂盒，江苏菲亚生物科技有限公司;Trizol试剂，碧云天生物科技有限公司;EvaGreen 2X qPCR MasterMixNo Dye试剂盒、5X AllInOne RT MasterMix试剂盒，美国ABM公司;测定基因相关引物，生工生物工程（上海）股份有限公司;SPF级4周龄雄性ICR小鼠，许可证号SCXK（京）20160002，北京斯贝福生物技术有限公司;45%脂肪供能高脂高糖饲料及小鼠维持饲料，北京华阜康生物科技股份有限公司。动物实验于屏障环境动物房[温度（22±2）℃、湿度50%±5%、压差20～50 Pa，12 h昼夜交替]进行，遵循国家及提供实验动物单位的实验动物福利规则和制度。

12仪器与设备

T 6新世纪紫外可见分光光度计、RE52 AA真空旋转蒸发仪、真空冷冻干燥机、Roche活力型血糖仪、Thermofisher Nanodrop 2000核酸蛋白检测仪、Nikon Eclipse Ci光学显微镜、Biometra Tpersonal梯度PCR仪、Roche lightcycler 96荧光定量PCR仪等。

13方法

131粗制茶多糖的制备与理化成分测定茶叶使用万能粉碎机磨碎，过40目筛备用。准确称量茶粉，参照保健食品功能学评价程序与检验方法规范中动物实验受试物相关的制备方法[10]，茶水比为1∶15，80℃水浴浸提1h，减压过滤，保留滤液，滤渣重复于80℃水浴浸提1h，再次减压过滤。合并两次滤液，冷却一段时间后于55℃条件下旋转蒸发得到浓缩液。之后在浓缩液中加入4倍体积的95%乙醇，超声溶解30min后，4 000 r/min离心15min，将沉淀物真空冷冻干燥36 h，分别得到粗制白茶多糖（CWP）、粗制绿茶多糖（CGP）、粗制红茶多糖（CBP），在4℃下密封保存[11]。分别采用苯酚硫酸比色法[12]测定茶多糖含量、考马斯亮蓝试剂盒法测定蛋白质含量、福林酚法[13]测定茶多酚含量、三氯化铝比色法[14]测定总黄酮含量。

132动物实验小鼠置于屏障环境动物房适应性喂养7 d后，随机选取其中10只喂养维持饲料，作为正常对照组（NC），其余小鼠喂养45%高脂高糖饲料。连续喂养4w后，禁食12h（隔夜），小鼠腹腔注射配制的STZ溶液110 mg/（kg·BW）。1w后测定血糖，空腹血糖（FBG）≥111mmol/L视为造模成功[15]。将造模成功后的小鼠按照FBG情况随机分为模型对照组（MC）、阳性对照组（PC）、CWP干预组、CGP干预组和CBP干预组，每组10只小鼠。茶多糖干预组参照已有研究[16]，制定小鼠灌胃剂量为300mg/（kg·d）。PC组选用盐酸二甲双胍，根据成年人的每日最大剂量（15 g），按照文献相关方法换算后，制定小鼠用药剂量为250mg/（kg·d）[17]。

133葡萄糖耐量实验4w干预结束前，将所有小鼠禁食不禁水15h（隔夜），取小鼠尾尖血，使用血糖仪测定FBG，作为0时血糖。测定之后马上给每只小鼠灌胃15g/（kg·BW）葡萄糖，记录灌胃后30、60、90、120 min血糖，并绘制时间血糖折线图[18]，按照式（1）计算每组折线的曲线下面积（AUC）。

AUC（mmol·h/L）=（A/2+B+C+D+E/2）/2（1）

式（1）中，A、B、C、D、E分别表示0、30、60、90、120 min时刻的血糖值。

134生化指标检测4w干预结束后，将小鼠禁食12h（隔夜），内眦采血，断颈处死。将血样在4℃、4 000r/min条件下离心15min，分离血清样本，于-20℃条件下保存。按照试剂盒说明书方法测定血清中胰岛素（FIS）含量。

135胰腺组织病理学分析剖取小鼠胰腺组织，置于体积为胰腺组织10倍的4%多聚甲醛固定液中固定48h。常规取材，脱水，石蜡包埋，制片（4μm厚），HE染色，光学显微镜观察胰腺组织的病理学变化，并以200倍视野拍照保存。

136实时荧光定量PCR检测Trizol试剂抽提小鼠肝脏RNA，使用氯仿、无水乙醇等试剂对RNA进行清洗处理。检测RNA浓度及质量后，按试剂盒标明的梯度程序反转录制备cDNA第一链，-20℃条件下保存。荧光定量采用10μL体系，按照试剂盒标明的梯度程序：95℃ 10 min、95℃ 15 s、60℃ 60 s，循环45次。以 GAPDH 为内参基因，采用2-（ΔΔCT）法[19]对各基因的表达水平进行分析。测定基因：叉头转录因子（Foxo1）、葡萄糖6磷酸酶（G6Pc）、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPCK）和硫氧还蛋白互作蛋白（TXNIP），引物序列如表1所示。

14数据处理

采用SPSS 200软件进行统计学分析，以均数±标准误差（X±SE）表示;组间均数比较采用单因素方差分析，P<005表示差异显著、P<001表示差异极显著。图像采用Origin 80软件处理。

2结果与分析

21茶多糖的主要成分

由表2可知，CWP中的多糖含量最高且显著高于CGP，粗制茶多糖提取物均含有多种杂质成分。

22茶多糖的降血糖作用相关测定结果分析

221茶多糖对糖尿病小鼠体重、始末血糖及胰岛素抵抗（HOMAIR）指数的影响造模成功后的小鼠均出现典型的“三多一少”症状，且体重变化较为明显。小鼠FBG在造模成功后会有显著上升，4w灌胃干预对小鼠糖尿病的治疗效果则可以通过最后1周和造模成功时FBG的变化来表明。改善小鼠的胰岛素抵抗水平可有效提高胰岛素敏感性，从而改善高胰岛素血症，降低小鼠血糖水平，衡量的指标之一为HOMAIR指数[2021]，计算公式为式（2）：

HOMAIR=FBG*FIS/225（2）

如图1A所示，NC组体重较为稳定，MC及PC组体重波动幅度较大，整体呈下降趋势。多糖干预组中CWP体重与其他组差异较为明显，但干预組均呈现整体下降趋势，在第3、4周趋于平缓甚至体重有所回升。为更加明显区分组间差异性，计算各组的体重增长百分比。如图1B所示，MC组、CTPs组均呈现负增长，未表现出较好的改善效果。如图1C所示，小鼠在造模成功后测定初始FBG，各组间无显著差异（P>005）。MC组经4w喂养后，FBG有所升高，但并未达到显著水平。药物和多糖干预组4w喂养后FBG均降低，PC、CWP、CGP、CBP组的血糖下降率分别为532%、470%、478%、367%。可知CTPs组降血糖效果均略逊于PC组，其中CGP组效果最好。如图1D所示，小鼠造模成功后的IR值明显增加，其中MC组和CWP组极显著高于NC组（P<001），同时CWP组和CBP组显著低于MC组（P<005），对缓解小鼠胰岛素抵抗水平有一定效果，PC组及CGP组则极显著低于MC组（P<001），均有很好地缓解胰岛素抵抗效果，多糖组中CGP组效果较好。

222茶多糖对糖尿病小鼠葡萄糖耐量的影响口服葡萄糖耐量试验（OGTT）是一种葡萄糖负荷试验，已广泛应用于临床实践中[22]。小鼠在4w喂养结束后进行该试验，如图2A所示，多数干预组血糖值灌胃葡萄糖30min后达到顶峰，之后逐步下降，少数干预组（CWP、CBP）血糖值在30～90min之间变化缓慢。NC组小鼠血糖在120min时恢复正常，MC组血糖下降较为缓慢，表现出明显的葡萄糖不耐受。为区分其他干预组的组间差异，对曲线AUC进行计算，如图2B所示，CWP组和CBP组较MC组有所下降，但未达到显著水平（P>005）;CGP组显著低于MC组（P<005），显示出较好地改善小鼠葡萄糖耐量的效果。

223小鼠胰腺组织的病理学分析如图3所示，NC组小鼠胰岛性状规则，胰岛细胞分布均匀，腺泡细胞形态正常，组织未发生病变。MC组小鼠胰岛形状不规则，腺泡结构被破坏，腺泡大量消失（黑色箭头所示），并伴有组织增生，可见较多丝网状物质（红色剪头所示），整体表明MC组胰岛损伤严重，有脂肪变性征兆。PC组胰岛性状不规则，大量胰岛细胞胞质疏松或呈空泡状（黑色箭头所示），局部胰岛附近可见淋巴细胞浸润（红色剪头所示），整体表明PC组小鼠胰岛细胞损伤较严重，可见二甲双胍药物对改善小鼠胰腺组织病变的效果并不明显。CTPs干预组中，CWP组小鼠胰岛形状不规则，少量胰岛细胞胞质呈空泡状（黑色箭头所示），组织整体未见明显异常;CGP组小鼠胰岛形状不规则，部分胰岛细胞胞质呈空泡状（黑色箭头所示），一处胰岛周围有少量淋巴细胞灶性浸润（红色剪头所示），未见其他明显异常;CBP组小鼠胰岛形状不规则，少量胰岛细胞胞质呈空泡状（黑色箭头所示），未见其他明显异常。整体表明，CTPs均能部分改善小鼠胰腺组织的病理状态，但组间差异不明显。

224茶多糖对糖尿病小鼠肝组织相关基因表达的影响Foxo1基因是胰岛β细胞的一种关键调控因子，对其增殖存在抑制作用[23]，进而导致胰岛素分泌减少，破坏糖代谢平衡，使血糖升高。由图4A可知，MC组的基因相对表达量极显著高于NC组（P<001），干预组与MC组相比均极显著下调了基因相对表达量（P<001），其中CGP效果最优。G6Pc基因和PEPCK基因均为糖异生途径调控基因，在肝脏中表达量的增加会促进非糖物质转化为葡萄糖，进而转运至血管中提高血糖水平[24]。由图4B、C可知，MC组的两种基因相对表达量均极显著高于NC组（P<001），药物和多糖干预组则与MC组相比均能够极显著下调两种基因的相对表达量（P<001），但各组之间无显著差异（P>005）。其中CGP效果最优。TXNIP基因是一种细胞炎症分子，其表达量的增加会促进胰岛β细胞的凋亡[25]。由图4D可知，MC组的相对表达量极显著高于NC组（P<001），与MC组相比，药物与多糖干预组均能极显著下调基因相对表达量（P<001）。多糖组效果均明显弱于PC组，其中CGP在多糖干预组中效果最优，表明其在消除炎症方面具有优势。

3讨论

本研究选取的茶多糖提取物均可改善小鼠的糖尿病症状。以血糖下降率为主要指标来看，降血糖效果整体呈现出绿茶多糖>白茶多糖>红茶多糖的规律，未与茶多糖的含量呈正相关，但随茶多酚含量的增加而提高。这表明茶叶中影响降血糖活性的因子不仅茶多糖一种，在茶多糖含量相对较少时，茶多酚可能会成为发挥降血糖功效的主要因子，也可能与茶多糖存在协同效应，进一步佐证了实验室前期在白茶和黄茶粗多糖的研究中得到的茶多糖并不是唯一降血糖因子的结果。实验所选茶多糖在调节糖尿病代谢途径相关基因表达方面也具有一定作用，均可下调糖异生途径关键基因G6Pc和PEPCK的表达量，抑制葡萄糖的生成，进而降低血糖。同时，茶多糖均可下调Foxo1基因的表达，减弱对胰岛β细胞的抑制，从而增加胰岛素分泌，改善糖尿病症状。此外，茶多糖对炎症分子TXNIP基因的表达也有抑制作用，缓解胰岛β细胞的凋亡，进而增加胰岛素分泌。茶多糖的降血糖活性会受到很多因素影响，降糖作用途径较多，靶点也不止一处[24]，纯度、剂量、吸收方式等因素对其降血糖活性的影响及茶多糖的其他作用途径和降糖靶点有待进一步研究。◇

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