APP下载

野生樱桃李清除DPPH自由基能力及抑制α—葡萄糖苷酶活性

2017-11-15刘伟腊萍杨如箴张莉欧阳艳

江苏农业科学 2017年17期
关键词:总黄酮降血糖抗氧化

刘伟+腊萍+杨如箴+张莉+欧阳艳

摘要:采用超声辅助提取不同月份野生櫻桃李叶,系统溶剂萃取其醇提物得到环己烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位,分别测定其总黄酮含量,通过清除DPPH自由基和α-葡萄糖苷酶抑制活性评价野生樱桃李叶不同提取物的抗氧化活性及体外降血糖活性。结果表明,野生樱桃李叶各提取物均有不同程度的抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性,其中以总黄酮含量较高的7、10月叶乙酸乙酯部位(129.48、102.19 mg/g)效果最佳,其对DPPH清除活性(IC50=0.05、0.30 mg/mL)远强于阳性对照BHA(IC50=0.99 mg/mL),α-葡萄糖苷酶抑制活性(IC50=114.44、20336 μg/mL)高于阳性对照阿卡波糖(IC50=1 047.32 μg/mL)。说明野生樱桃李叶乙酸乙酯部位具有开发治疗糖尿病降血糖药物的价值。

关键词:野生樱桃李叶;总黄酮;抗氧化;DPPH自由基;α-葡萄糖苷酶活性;降血糖;清除活性

中图分类号: R284.1文献标志码: A文章编号:1002-1302(2017)17-0183-03

糖尿病(diabetes mellitus)是一种以胰岛素分泌绝对不足(Ⅰ型)或相对不足(Ⅱ型,胰岛素抵抗)而引起的以高血糖为主,伴有眼、肾、心脏、血管、神经系统的慢性损害等并发症为特征的内分泌代谢性疾病[1]。目前,在全球疾病对人类危害的排行榜中,糖尿病跃居第3位,已成为严重危害人类健康的疾病之一。Yang等研究表明,我国糖尿病早期表现出更严重的胰岛β细胞功能障碍,治疗的关键是维持胰岛β细胞功能和控制餐后血糖浓度[2]。α-葡萄糖苷酶是存在于小肠绒毛膜刷状缘上的催化淀粉、蔗糖和麦芽糖水解为葡萄糖和果糖的一组酶系,对调节体内碳水化合物的代谢具有重要的作用。其抑制剂可竞争性抑制酶的活性,从而减缓淀粉和蔗糖等向葡萄糖转化,进而控制餐后血糖水平[3]。此外,氧化应激与糖尿病及其并发症密切相关,应用抗氧化治疗可逆转氧化应激对组织的损伤,从而阻止或延缓糖尿病及其并发症的发生、发展[4-5]。因此,开发具有清除自由基和控制餐后血糖的功能保健食品对我国Ⅱ型糖尿病的防治有重要的意义。

野生樱桃李(Prunus divaricata Ldb.)别称野酸梅,蔷薇科李属,落枝灌木或小乔木。植株高1.5~8.0 m,多分枝,枝条细长,深绿色,主要分布于中亚天山、高加索、小亚细亚及巴尔干半岛,在我国仅分布于新疆霍城县的大西沟和小西沟[6-7]。有文献报道,野生樱桃李果实营养成分种类齐全,氨基酸丰富,多酚和矿物质含量较高,是难得的天然保健食品[6-8]。笔者前期研究发现,野生樱桃李叶含有丰富的多酚和黄酮类化合物,并具有较好的抗氧化活性[9-10],但鲜见对野生樱桃李抑制α-葡萄糖苷酶活性的报道。本研究采用体外α-葡萄糖苷酶抑制模型,对不同月份野生樱桃李叶的醇提物和萃取物进行活性初筛,以期发现基于抑制α-葡萄糖苷酶活性的降血糖活性成分,为野生樱桃李的利用与开发提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料、试剂与仪器

材料与试剂:野生樱桃李叶分别于7、10月采自霍城县大西沟,经伊犁师范学院资源与生态研究所赵玉副教授鉴定为蔷薇科野生樱桃李叶,洗净、晾干后60 ℃烘干至恒质量,粉碎过60目筛备用,树叶标本存放于伊犁师范学院资源与生态研究所。石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、无水乙醇、氯化铝、醋酸、醋酸钠、甲醇,购自国药集团化学试剂有限公司;DPPH(长城生物化学工程有限公司);芸香苷标准品购自中国食品药品检定研究院(批号100080-201408);α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷、阿卡波糖,购自阿拉丁试剂(上海)有限公司。

仪器:SpectraMax M2多功能读板机[美谷分子仪器(上海)有限公司];UV-2550紫外可见分光光度计(日本岛津分析仪器厂);XH-2008D智能温控低温超声波催化合成仪(北京祥鹄科技发展有限公司);DD-5M型低速离心机(湘仪离心机仪器有限公司);FA2104电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司);BAO-150AG型电热恒温干燥箱(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2试验方法

1.2.1野生樱桃李叶提取物及萃取物制备参照文献[9]的方法,精确称取10.000 0 g备用7月野生樱桃李叶2份,分别装入500 mL三颈烧瓶内,按料液比1 ∶30(g ∶mL)加入60%乙醇溶液,在300 W功率下70 ℃超声提取30 min,提取2次,合并提取液,4 000 r/min离心10 min,所得上清液1份减压浓缩干燥后得7月叶提取物(Jul E)1.605 8 g;1份减压浓缩至无醇味,将所得浸膏悬浮于200 mL蒸馏水中,依次用等体积的环己烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次,回收溶剂后得7月叶环己烷部分(J-Cy E)0.082 2 g、乙酸乙酯部分(J-EA E)0.429 6 g、正丁醇部分(J-Bu E)0.515 3 g。按照上述方法制备10月叶提取物(Oct E)1.561 5 g及10月叶环己烷部分(O-Cy E)0.193 6 g、乙酸乙酯部分(O-EA E)0.352 7 g、正丁醇部分(O-Bu E)0.524 9 g。

1.2.2总黄酮含量测定参考文献[11]的方法,采用氯化铝法分别测定野生樱桃李叶不同提取物及萃取物总黄酮含量。精确移取备用芸香苷标准溶液0.0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL,分别加入盛有5.0 mL 60%乙醇溶液的25 mL相同规格的容量瓶中,再加2.0 mL 0.1 mol/L氯化铝溶液和1.0 mL醋酸-醋酸钠缓冲液(pH值=5.5),60%乙醇溶液定容至刻度,摇匀,放置15 min,于417 nm处测定吸光度。以芸香苷标准溶液质量浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,得 y=27.462 0x+0.000 6,r2=0.995 9。结果表明,在浓度 0.02~0.06 mg/mL范围内2个变量呈现良好的线性关系。准确吸取1.0 mL配制的提取液,分别按照上述方法测定吸光度,并根据公式(1)计算总黄酮含量。endprint

Y=k×C×Vm。(1)

式中:Y为总黄酮含量,mg/g;k为待测液与测试液体积之比;C为标准曲线法计算所得浓度,mg/mL;V为测试液定容的体积,mL;m为称取野生樱桃李叶或萃取物质量,g。

1.2.3清除DPPH自由基试验参照文献[12] 的方法并稍加修改:配制野生樱桃李叶提取物及萃取物、阳性对照BHA待测液,逐级稀释使用。将各供试样品溶液分别移取20 μL于 10 mL 比色管中,另取0.6 mmol/L DPPH溶液1.0 mL加入各比色管中,无水乙醇定容至10 mL,摇匀,在避光条件下静置30 min后,于517 nm波长处测定吸光度,考虑待测样品自身吸光度的影响,配制未加DPPH溶液的对照组扣除其吸光度,每组样品进行3次平行试验。DPPH清除率按公式(2)计算:

DPPH清除率=D0-(D1-D2)D0×100%。(2)

式中:D0为DPPH溶液定容后的吸光度;D1为不同浓度的样品溶液添加DPPH溶液定容后的吸光度;D2为不同浓度的样品溶液定容后的吸光度。

1.2.4α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定参照文獻[13]的方法稍作修改:96孔板中分别加入50 μL不同浓度的甲醇和0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH值=6.8,精确称取8.66 g K2HPO4、6.85 g KH2PO4溶解于超纯水中,并定容至1 L)的被测试样品,50 μL磷酸盐缓冲液和40 μL 0.25 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液,每个样品设3个复孔,37 ℃恒温孵育 10 min 后加入40 μL 5 mmol/L pNPG溶液,立即于405 nm波长处测定其吸光度(S0),反应5 min后相同波长条件下测定其吸光度(S5),加入相同体积的甲醇磷酸盐缓冲液为空白对照,阿卡波糖为阳性对照。按照公式(3)计算抑制率:

抑制率=[(C5-C0)-(S5-S0)]/(C5-C0)×100%。(3)

式中:C0为加入缓冲液代替样品的空白对照0 min时的吸光度;C5为空白对照5 min时的吸光度;S0为加入测试样品 0 min 时的吸光度;S5为加入测试样品5 min时的吸光度。

1.2.5数据分析采用Origin 8.0作图,Excel 2003进行数据分析并计算抑制率、清除率,根据抑制率和浓度采用FORECAST函数计算IC50。

2结果与分析

2.1野生樱桃李叶提取物及萃取物总黄酮含量测定结果

黄酮类化合物是植物花、叶等器官中的重要次级代谢产物,在治疗心血管病、抗病毒、抗肿瘤、保肝、抑菌、抗衰老等方面有广泛的用途。由图1可知,7月叶中总黄酮含量高于10月。有文献报道,光照能够强烈地影响植物的初生代谢、植物细胞生长及次生代谢产物积累[14]。由此推测,新疆伊犁地区7月日照时间较10月长,紫外线辐射强度大,影响了野生樱桃李正常的生理活动,促使其局部组织或器官合成较多的黄酮类化合物,以利于自身的保护。7月野生樱桃李叶不同萃取部位中J-EA E总黄酮含量最高,为(129.48±1.03)mg/g,其次为J-Bu E,J-Cy E总黄酮含量最低;10月野生樱桃李叶不同萃取部位中O-EA E总黄酮含量最高,为(102.19±1.19)mg/g,O-Bu E略高于O-Cy E。表明野生樱桃李叶萃取物中富含中等极性黄酮类化合物。

2.2野生樱桃李叶不同提取物清除DPPH自由基活性

在多种快速评估抗氧化活性的方法中,清除DPPH自由基模型与其他方法相比使用更广泛。由图2可知,在测试质量浓度内,各提取物清除DPPH自由基活性呈现出浓度依赖性,且活性差异明显。采用较为客观的IC50值评价野生樱桃李叶不同提取物及萃取物清除DPPH自由基活性。测试浓度为1.0 mg/mL时,7月不同提取物及萃取物清除DPPH活性顺序为J-EA E>Jul E>J-Bu E>J-Cy E;10月不同提取物及萃取物清除DPPH活性顺序为O-EA E>O-Cy E>O-Bu E>Oct E。其中J-EA E(IC50=0.05 mg/mL)对DPPH清除活性最强,远高于阳性对照BHA(IC50=0.99 mg/mL);不同月份醇提物之间比较,Jul E(IC50=0.49 mg/mL)活性要高于Oct E(IC50=0.65 mg/mL);7月各萃取部位活性均高于10月相应萃取部位,但O-Cy E(IC50=0.44 mg/mL)活性远高于J-Cy E活性。结合图1可知,不同提取物DPPH清除能力与其总黄酮含量存在密切关系。

2.3野生樱桃李叶不同提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制活性

由表1可知,7月叶醇提物的抑制率明显高于10月叶醇提物,但两者的总黄酮含量没有明显差异,推测两者所含黄酮种类或黄酮类化合物各组分的比例有差异。7月不同提取物及萃取物对 α-葡萄糖苷酶抑制率顺序为J-EA E>J-Bu E>Jul E>J-Cy E,10月不同提取物及萃取物对α-葡萄糖苷酶抑制率顺序为O-EA E>O-Bu E>O-Cy E>Oct E。其中J-EA E(IC50=114.44 μg/mL)和O-EA E(IC50=203.36 μg/mL)抑制率远高于阳性对照阿卡波糖(IC50=1 047.32 μg/mL);J-Cy E(未测得其IC50)抑制活性最弱,远低于O-Cy E(IC50=592.67 μg/mL)。结合图1可知,总黄酮含量较高的乙酸乙酯部位表现出更好的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

表1野生樱桃李叶不同提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制率

处理初筛浓度

(μg/mL)抑制率

(%)IC50

(μg/mL)Jul E2 00061.91±0.24838.47Oct E2 00051.62±0.651 599.60J-Cy E2 00032.62±1.84J-EA E2 00095.53±0.29114.44J-Bu E2 00063.22±0.43780.55O-Cy E2 00068.71±1.09592.67O-EA E2 00089.05±0.98203.36O-Bu E2 00069.78±1.28611.70BHA2 00067.25±1.431 047.32endprint

2.4各提取物质量浓度对α-葡萄糖苷酶抑制活性的影响

由图3可知,当供试质量浓度小于1.0 mg/mL时,各提取物对α-葡萄糖苷酶抑制活性与浓度呈现明显的量效关系,即抑制率随着质量浓度的升高而逐渐增大,其中总黄酮含量较高的J-EA E和O-EA E抑制α-葡萄糖苷酶活性较好,在质量浓度为1.0 mg/mL时,两者对α-葡萄糖苷酶抑制率分别为92.58%、86.43%,远高于BHA的抑制活性(47.85%),此后两者抑制率随着浓度增大变化不明显。

3结论与讨论

本研究对野生樱桃李叶不同月份醇提物和萃取物的体外抗氧化活性和降血糖活性进行了比较。结果表明,不同月份

野生樱桃李叶醇提物总黄酮含量没有明显差异,但7月野生樱桃李叶醇提物DPPH清除能力和抑制α-葡萄糖苷酶活性强于10月醇提物;不同月份萃取物均表现出不同程度的活性,其中总黄酮含量较高的乙酸乙酯部位具有强氧化活性的同时也表现出较好的α-葡萄糖苷酶抑制活性,说明乙酸乙酯萃取物具有开发治疗糖尿病降血糖药物的价值,黄酮类化合物与其活性之间存在密切关系。

参考文献:

[1]American Diabetes Association. Diagnosis and classification of diabetes mellitus[J]. Diabetes Care,2014,37(S1):81-90.

[2]Yang W Y,Weng J P. Early therapy for type 2 diabetes in China[J]. The Lancet Diabetes & Endocrinology,2014,2(12):992-1002.

[3]Kim K T,Rioux L E,Turgeon S L. Alpha-amylase and alpha-glucosidase inhibition is differentially modulated by fucoidan obtained from Fucus vesiculosus and Ascophyllum nodosum[J]. Phytochemistry,2014,98(1):27-33.

[4]Khan R A,Khan M R,Sahreen S,et al. Assessment of flavonoids contents and in vitro antioxidant activity of Launaea procumbens[J]. Chemistry Central Journal,2012,6(20):1-11.

[5]霍麗妮,刘华钢,廖艳芳,等. 两粤黄檀体外抗氧化及α-葡萄糖苷酶抑制活性研究[J]. 江苏农业科学,2014,42(5):242-244.

[6]齐曼·尤努斯,帕提古丽,木合塔尔,等. 新疆野生樱桃李的营养成分[J]. 新疆农业科学,2005,42(4):240-243.

[7]张卫明,钱学射,顾龚平. 中国李的民族植物学[J]. 中国野生植物资源,2004,23(4):1-4.

[8]刘伟,杨如箴,李紫薇,等. 响应面法优化新疆野酸梅果肉多酚提取工艺研究[J]. 北方园艺,2014(4):123-126.

[9]刘伟,何晓燕,陈文强,等. 响应面优化野生樱桃李叶总黄酮的超声辅助提取工艺[J]. 天然产物研究与开发,2015,27(10):1765-1770.

[10]刘伟,李紫薇,陈文强,等. 新疆野生樱桃李枝、叶不同萃取部位抗氧化活性研究[J]. 食品工业科技,2016,37(3):119-122.

[11]刘伟,高红艳,李紫薇,等. 野生樱桃李叶总黄酮含量测定方法比较研究[J]. 江西农业大学学报,2016,38(1):192-197.

[12]孙雪婷,袁俊杰,蒋玉蓉,等. 藜麦种子总黄酮提取及其抗氧化性[J]. 江苏农业科学,2015,43(10):355-358.

[13]Wan C,Yuan T,Cirello A L,et al. Antioxidant and α-glucosidase inhibitory phenolics isolated from highbush blueberry flowers[J]. Food Chemistry,2012,135(3):1929-1937.元向东,王海峰. 骨胶原蛋白的脱苦试验[J]. 江苏农业科学,2017,45(17):186-188.endprint

猜你喜欢

总黄酮降血糖抗氧化
吃素无法降血糖
6000倍抗氧化能力,“完爆”维C!昶科将天然虾青素研发到极致
交泰丸中小檗碱联合cinnamtannin D1的降血糖作用
不同提取方法对骨碎补中总黄酮含量的影响比较
猪皮胶原蛋白抗氧化肽的分离纯化及体外抗氧化活性研究
乳清低聚肽的制备及其抗氧化活性
绿茶抗氧化肽的分离纯化与抗氧化活性研究
白背三七总黄酮对糖尿病大鼠的降血糖作用
荔枝肉水溶性多糖降血糖作用