张攀 孙艳美 张萍萍 马聪 苗绘 李亚丽

自然流产的临床发生率10%～15%，超过80%的自然流产发生在妊娠早期[1]。目前自然流产的发病机制尚不清楚，导致自然流产的因素包括遗传、内分泌、感染、解剖因素及母体自身免疫系统疾病等，其中遗传因素尤其是胚胎染色体异常是自然流产发生的主要原因，约占早期自然流产的50%[2]。研究发现70%的偶发性流产是由胚胎染色体异常引起的[3]。本研究通过高通量测序及传统G显带技术对自然流产组织物进行了细胞遗传学分析，探讨不同检测方法的优缺点，为临床遗传咨询提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2016年9月至2017年3月于河北省人民医院生殖遗传科就诊的自然流产患者192例为研究对象，平均流产年龄(29.40±4.18)岁，终止妊娠平均孕龄(9.23±2.53)周。患者均经超声确认宫内妊娠，并提示胚胎停止发育，且排除外伤、感染、发热等因素所致，在充分实验告知并签署知情同意书的原则下，于无菌条件下采取胚胎绒毛组织，进行高通量测序或细胞遗传学G显带检测。

1.2 方法 经研究对象本人签署知情同意书后采集绒毛组织标本，收集刮宫后的绒毛组织，用0.9%氯化钠溶液充分洗涤绒毛组织至无明显血液残留，取新鲜标本送检或-80℃冰箱保存备用。

1.2.1 细胞遗传学G显带

1.2.1.1 试剂与仪器:主要试剂包括秋水仙素100 μg/ml(Sigma公司)，主要仪器包括TGL-16G台式离心机(上海医用分析仪器厂)、恒温水浴箱(上海市医疗器械一厂)、恒温培养箱(NBS公司)、Leica全自动染色体分析系统(德国Leica公司)。

1.2.1.2 实验步骤:选取10 mg左右优质绒毛组织放入37℃的无菌加微量肝素0.9%氯化钠中冲洗2～3次，与预温37℃含秋水仙素浓度为0.1～0.4 μg/ml的1%枸橼酸钠5 ml充分混匀，并进行30 min低渗。低渗完成后加入1 ml甲醇：冰醋酸(3∶1)，混匀5 min进行预固定，然后换新鲜固定液置室温固定30 min。弃去固定液，顺管壁加入60%冰醋酸1 ml，1～2 min后，由管底部缓缓加入甲醇3 ml，轻轻混匀，固定5 min时用滴管将绒毛挑出，再离心5 min去上清液。加入2～3滴新鲜固定液，轻轻混匀，以冰片进行滴片，然后立即于60℃烤箱内放置16～24 h或置于37℃下72 h，待其自然冷却后即可进行姬姆萨染色显带；显带完成后进行染色体核型分析：每张片子显微镜下计数20 个中期分裂相，分析2个细胞核型，记录染色体数目和结构畸变；如是嵌合型病例，每个细胞系至少分析2个细胞。

1.2.2 高通量测序

1.2.2.1 试剂与仪器:主要试剂包括Next DNA双链片段化酶(M0348S，NEB)、QIAamp DNA Blood Mini Kit 核酸提取试剂盒(51104，QIAGEN)、胎儿染色体非整倍体(T21、T18、T T13)检测试剂盒(320020-01，博奥生物)、QubitTMdsDNA HS Assay Kit(Q32851，Thermo fisher)。主要仪器包括PCR仪(Veriti，ABI)、Thermomixer(Thermomixer comfort，Eppendorf)、低温离心机(5804R，Eppendorf)、低温高速离心机(5424R，Eppendorf)、荧光定量PCR仪(Stepone plus，ABI)、测序仪(BES4000，博奥生物)、Nanodrop分光光度仪(Nanodrop one，Thermo fisher)、浓度测定仪(Qubit 3.0，Thermo fisher)。

1.2.2.2 实验步骤:取胎儿绒毛组织100 mg，用PBS或0.9%氯化钠溶液清洗3～5次，通过QIAamp DNA Blood Mini Kit核酸提取试剂盒提取全基因组DNA，并对提取的样品进行质控检测，应用Qbuit、Nanodrop one对DNA质量进行检测，确保DNA浓度不低于30 ng/μl，260/280值在1.8～2.0，没有蛋白、多糖和RNA污染，没有降解。采用酶切法，将样品DNA酶切成100～200 bp大小的片段。使末端修复酶将片段化后形成的粘性末端DNA修复成平末端，然后用磁珠法纯化产物。使用DNA连接酶给末端修复后DNA两端加上P1接头和特异标签，然后用磁珠法纯化产物。通过PCR技术(10个循坏)扩增两端带有接头和标签的DNA片段；上述步骤反应后的DNA使用磁珠法纯化产物。使用QPCR检测文库浓度，确保浓度>5 nmol/L。构建好的文库经QPCR检测合格后，将一定量的文库按照等物质的量混合，然后在BES4000上测序。数据分析：基于拷贝数变异的检测方法，引入GC校正和LOSS校正，用博奥自主开发的比对软件，将每个读长的测序碱基与人类基因组参考序列(hg19)进行比对，对比对上的读长数据进行染色体异常分析。

1.3 分组 对检测成功的146例进行分组。(1)根据年龄分为20～24岁，25～29岁，30～34岁，35～39岁，≥40岁5个亚组。(2)根据根据自然流产次数：自然流产1次66例，自然流产2次46例，自然流产≥3次34例。(3)根据自然流产孕周分为：<8周16例，8～11+6周106例，≥12周15例，另有缺失8例。

2 结果

2.1 绒毛染色体G显带及染色体核型分析 共收集192例自然流产患者的胚胎组织,61例进行绒毛染色体G显带，检测成功15例，成功率为24.6%，在培养成功中发现异常核型8例(53.3%)，其中染色体非整倍体4例(47,XN,+22，47,XN,+2，47,XN,+7，47,XN,+9)，46,XN,+mar 1例，三倍体2例，四倍体1例。

2.2 高通量测序检测结果 应用高通量测序测序131例，所有样本检测成功，检测成功率为100%，显著高于绒毛染色体G显带技术(χ2=129.912，P<0.05)。发现异常核型57例(43.5%)，其中非整倍体50例，单体11例，三体39例，单体主要为45,X，此外还有21单体1例。最常见的非整倍体异常核型为16-三体13例(22.8%)，45,X 10例(17.5%)。在57例染色体异常核型中，结构异常7例，平均流产孕周为(9.87±1.79)周，且主要集中在4号、8号染色体的微缺失、微重复，其中病例1所示结果为重复、缺失嵌合型，为非已知致病变异，其他6例均涉及到已知的致病基因，该序列缺失或重复可以引起生长迟缓、智力低下、结构异常等。见表1。

表1 7例染色体结构异常核型

2.3 2种检测技术比较及异常染色体核型分析 综合两种技术方法192例自然流产患者中146例流产组织染色体核型检测成功，其中胚胎染色体核型异常率占44.5%(65/146)，染色体数目异常占89.2%(58/65)。其中，非整倍体55例，单体11例，三体44例，多倍体3例，双重三体2例，嵌合体5例，结构异常8例。最常见的非整倍体异常核型为16-三体20%(13/65)，45,X约占15.4%(10/65)。见表2。

表2 146例自然流产染色体异常核型分析

2.4 孕妇年龄、自然流产次数、自然流产孕周与染色体异常 146例自然流产孕妇中，根据年龄分为5个亚组，年龄≥40岁组的染色体异常核型发生率最高，年龄25～29岁组的染色体异常核型率最低；根据流产次数分为3个亚组，3组染色体异常率均>40%，自然流产2次的异常核型比率最高为47.8%；根据流产孕周分为3个亚组，流产孕周<8周的染色体异常核型发生率为12.5%明显低于其他2组。见表3。

表3 各因素与异常染色体核型发生率比较

3 讨论

自然流产是一种妊娠期最常见的并发症，且其患病率呈逐年上升的趋势。染色体异常是自然流产的主要原因之一，研究认为自然流产的胚胎组织中染色体核型异常者约占50%[5]。绒毛细胞和胚胎组织均是由受精卵有丝分裂产生，携带的遗传信息相同，因此可以作为标本检查了解胚胎染色体的情况，查找自然流产的病因，为临床诊疗工作提供依据。

本实验中检测绒毛染色体的方法采用的是绒毛染色体细胞培养G显带分析及高通量测序技术。绒毛染色体细胞培养G显带核型分析的方法是对中期分裂相进行数目或结构异常的判断，可以准确检出自然流产物或胎儿染色体结构和数目的异常，是检测自然流产组织染色体核型异常或产前诊断的金标准。该方法技术稳定、质量可靠且费用低，提供了染色体改变的完整图，在临床应用较广泛。然而，该技术也存在不足之处即耗时长，成功率直接受制于绒毛组织的新鲜程度和绒毛的形态，且难以检出微小的染色体畸变(<5 Mb)。高通量测序，也称为下一代测序技术，可以对数十万到数百万个DNA分子进行并行测序，最小可以检测到10 kb的微小片段异常，并且其操作简单，不需要耗时的细胞培养，分析周期短，特异性及分辨率高，覆盖整个基因组。然而，缺点是成本高且不能发现染色体平衡易位、倒位、点突变及多倍体，因此不作为临床实践中的常规检测方法，而作为常规染色体核型分析的补充检测手段[6]。本研究中将192例自然流产患者的绒毛或胚胎组织，61例进行绒毛染色体G显带检测，检测成功率为24.6%。131例进行高通量测序检测，检测成功率达100%。绒毛染色体G显带的成功率明显低于高通量测序检测，二者之间差异有统计学意义(P<0.05)。绒毛染色体G显带检测失败的标本，可能由于胚胎停育时间长，组织不新鲜，形态差导致细胞未见分裂相，贴壁细胞生长，单细胞状态差，绒毛组织已老化。因此，高通量测序测序检测与绒毛染色体G显带检测相比更有优越性，操作简单，且检测不易受细胞组织新鲜度的影响，临床工作应用中二者可相结合。

胚胎染色体异常中以染色体数目异常最常见，多以染色体非整倍体为主[7]，其中16-三体综合征和45,X最为常见，其次是2，13，15，18，21，22号染色体三体。本组资料中染色体异常核型率为44.5%，染色体数目异常约占染色体异常的89.2%，且以非整倍体为主，其中前几位的非整倍体异常核型为16-三体约占20.0%，45,X约占15.4%，22-三体约占7.4%，2-三体约占7.4%，15-三体约占5.6%基本与既往的研究结果相符，常染色体三体是染色体异常的主要核型[8]。姐妹染色单体减数分裂不分离和过早分离，是导致胎儿非整倍体精子和卵子发生的主要机制[9]。16号染色体是亚端着丝粒染色体，22号、15号为端着丝粒染色体。着丝粒的位置与纺锤丝结合位点有关，可对姐妹染色单体的会聚与分离产生影响。端着丝粒染色体、亚端着丝粒染色体更易发生非整倍体。本组结果中21-三体核型为2例，发生率较低，由于此种核型的胎儿多可出生并长期生存，故在自然流产中发现的较少。此外有研究认为自然流产中最常见的16-三体、21-三体、22-三体综合征是与孕妇年龄密切相关的，具体机制不详，可能是由于随着年龄的增长，卵泡刺激素水平升高，卵巢储备功能下降，卵子老化，纺锤体聚合检验点蛋白的表达下降，导致纺锤体功能异常，当卵母细胞减数分裂时更易于形成非整倍体[10]。高龄孕妇体内的卵子在卵巢内储存的时间较长，受到外界长期的危害，产生积累效应可致染色体畸变及基因突变，受精后更容易出现染色体数目及结构的异常。本组数据所得年龄≥40岁的染色体异常率最高，25～29岁染色体异常率最低，因例数较少，未行统计学分析。本组数据所得三倍体分别为69,XXY、69,XXX，研究发现约70%的胚胎染色体三倍体是母系起源的，相反，性染色体非整倍体异常更多是父系起源的(50%的47,XXY，100%的47,XYY和70%～80% 的45,X)[11]。

本组数据所得在异常核型中非整倍体发生率为84.6%，远高于其他因素，表明非整倍体是导致自然流产的重要原因。然而，文献报道染色体微结构的基因拷贝数变异是自然流产的重要原因[12]。本研究中共有7例存在染色体微缺失、微重复，约占异常核型的10.8%，其中微缺失占71.4.%，微重复占85.7%，微重复率明显高于微缺失，提示染色体的微重复比微缺失可能更容易影响胚胎发育，导致自然流产。理论上人类染色体每个片段上都带有一定的遗传基因，如果存在缺失或重复，都有相对应的疾病，但是由于目前的技术水平限制，这些缺失及重复片段的致病性，目前没有完全明确。在本研究中，6例病例中微缺失、微重复的片段均存在已知致病变异，且染色体的结构异常主要存在于4号及8号染色体的微缺失、微重复。据文献报道，4号染色体的微缺失、微重复主要表现为骨骼、心血管等多发性畸形，且多伴有生长迟缓、智力低下、代谢紊乱，而畸形程度取决于缺失、重复片段的长度。8号染色体的微缺失、微重复主要表现为精神发育迟滞，颅面部、眼、心脏及骨骼的畸形，胎儿期多存在宫内发育迟缓及羊水过少等症状[13]。其余6、7、11、12、15号染色体上的微缺失及微重复基本上也集中表现在生长发育迟缓、多部位先天性畸形。

有文献报道，流产发生的越早，胚胎染色体异常的发生率越高[14]。在不同的研究中，自然流产异常核型的发生率在妊娠12周之前为50%～60%[15]。这一比率根据孕妇的年龄而变化，孕妇年龄<35岁的约为35%，而孕妇年龄≥35岁的约为80%[16]。本组数据12周之前自然流产异常核型发生率为42.3%，略低于文献报道，究其原因可能是研究对象的平均流产年龄为(29.40±4.18)周，低于35周岁。有研究报道，自然流产主要集中在8～12周，本研究中数据所得胚胎染色体异常发生在8～12周者占82.0%(50/61)，且流产孕周<8周的异常核型率最低，与既往的研究数据基本相符。

随着流产次数的增加，胚胎染色体异常的可能性却随之降低，然而却又报道认为，染色体异常率与流产次数无明显相关性，可能与外界的物理、化学因素及生殖器官的畸形相关[17]。本组数据所得自然流产2次的异常核型率较其他组稍高，但由于本研究数据量较小，未能明确其相关性，仍需扩大样本量明确两者之间关系，提前评估再次妊娠的流产风险。

综上所述，胚胎染色体异常是自然流产的主要原因，且以非整倍体异常为主，染色体的结构异常主要为4号染色体、8号染色体的微缺失、微重复。本研究通过对传统的细胞遗传学G显带、高通量测序技术对比研究，发现高通量测序技术检测成功率明显高于绒毛染色体G显带，且更适用于胚胎组织，更能快速、有效检出染色体的微缺失、微重复，是对传统的细胞遗传学G显带的一个有效补充，可以明显降低漏诊率，但由于高通量测序技术价格昂贵，建议临床医生在工作中科学地选择两种检测技术，合理结合有效指导临床。