夏培 熊宇 张万里 田爱霞 丁祥武 胡艳艳

胃癌是常见的恶性肿瘤之一，其病死率在所有恶性肿瘤中占据第二，仅次于肺癌[1]。基因的异常表达是胃癌发生发展的本质原因，包括原癌基因的激活、抑癌基因的失活等[2]。因此，从分子水平阐明胃癌的发生发展过程，探寻可靠的早期诊断标志物和新的治疗策略具有重要意义。人类转录因子叉头框Q1(forkhead box Q1，FOXQ1)基因属于Fox转录因子家族，是一种转录调控因子，其编码的蛋白质由403个氨基酸组成。FOXQ1的生物学功能已在毛囊分化中得到明确鉴定[3]。近年来研究发现FOXQ1在肺癌、结直肠癌、胶质瘤中异常表达，且与肿瘤生长、转移及预后显著相关[4-6]。近期研究表明，FOXQ1在胃癌组织的表达显著高于癌旁组织，且与胃癌病理分级、临床分期及淋巴结转移密切相关[7]，然而，FOXQ1的高表达是否有助于胃癌的发展和进展尚不清楚。SHH信号通路参与细胞分化、增殖、凋亡以及器官形成等过程[8,9]。近期发现FOXQ1基因可介导大肠癌SW480细胞血管生成与SHH信号通路有关[10]。本实验首先检测了胃癌细胞系中FOXQ1基因表达水平，并通过沉默胃癌SGC-7901细胞FOXQ1基因，观察该基因对SGC-7901细胞凋亡和SHH信号通路相关蛋白的影响，探讨其是否介导SHH信号通路影响胃癌细胞的凋亡。

1 材料与方法

1.1 细胞株、主要试剂 人永生化胃黏膜上皮细胞GES-1及人胃癌细胞SGC-7901、MKN-28、GC-9811和AGS购自上海中科院细胞库，RPMI-1640培养基、胎牛血清购自美国Hyclone公司，Trizol试剂、Lipofectamine 2000转染试剂、SYBR Green PCR Master Mix试剂盒购自美国Invitrogen公司，BCA蛋白浓度检测试剂盒、AnnexinⅤ-FITC凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所，非特异性FOXQ1 siRNA和非特异性FOXQ1 siRNA购自上海吉玛制药技术有限公司，Bax、Cleaved Caspase3、SHH、Smo、Gli1和Gli3抗体及辣根过氧化酶标记的二抗购自美国Abcam公司，SHH信号通路的特异性激活剂2,6,9-三取代嘌呤化合物(Purmorphamine，PM)购自美国Cayman公司。

1.2 细胞培养 人永生化胃黏膜上皮细胞GES-1及人胃癌细胞SGC-7901、MKN-28、GC-9811和AGS均培养于含有100 U/ml青霉素、100 U/ml链霉素及100 g/L胎牛血清的RPMI-1640培养基，培养条件是37℃，5% CO2、饱和湿度培养箱。待细胞密度达80%以上时，使用2.5 g/L的胰蛋白酶消化细胞，传代培养，每3～4天传代1次。

1.3 细胞转染与分组 取对数生长期的胃癌SGC-7901细胞接种于6孔板中，每孔2×105个细胞。细胞融合至60%时，按照Lipofectamine 2000转染试剂说明书分别转染特异性FOXQ1 siRNA、非特异性FOXQ1 siRNA至SGC-7901细胞，命名为si-FOXQ1组和si-Control组，并设置正常对照组(Normal组)。通过绿色荧光的表达程度摸索出细胞最佳转染浓度及转染时间。转染时间为48 h时转染效率最高。收集转染48 h 的各组细胞用于后续实验。

1.4 qRT-PCR检测细胞FOXQ1 mRNA的表达 按照Trizol试剂说明书提取细胞中RNA，超微量蛋白核酸检测仪测定RNA浓度和纯度，根据逆转录试剂盒说明书将总RNA反转录合成cDNA，使用SYBR Green PCR Master Mix试剂盒进行实时荧光定量PCR扩增，FOXQ1上游引物：5’-CGGAAGAGGACTCCGGAAAAG-3’，下游引物：5’-GTCGTACCCTCTTCCTTCGC-3’。PCR反应条件为：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸15 s，共40个循环。采用β-actin为内参，以2-ΔΔCt法计算细胞中FOXQ1相对表达量。

1.5 Western blot检测细胞中蛋白表达 取各组细胞，加入细胞裂解液，置冰上孵育30 min，收集细胞中蛋白，BCA蛋白检测试剂盒对总蛋白进行定量，取50 μg蛋白样品行12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白，转膜至硝酸纤维素膜上，封闭1 h，加入一抗孵育，Bax一抗1∶500稀释、Cleaved Caspase3一抗1∶500稀释、SHH一抗1∶800稀释、Smo一抗1∶800稀释、Gli1一抗1∶800稀释和Gli3一抗1∶800稀释，4℃过夜孵育，TBST洗膜(3×10 min)，加入二抗孵育(辣根过氧化酶标记的二抗1∶3 000稀释)2 h，TBST洗膜(3×10 min)，化学发光显色，显影、定影，在成像系统中拍照，以GAPDH为内参，统计细胞中Bax、Cleaved Caspase3、SHH、Smo、Gli1和Gli3蛋白相对表达水平。

1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡 取转染48 h后的细胞，预冷的PBS洗涤，加入1×Annexin结合液重悬细胞，调整细胞浓度为1×106个/ml。取100 μl细胞悬液，加5 μl Annexin和5 μl PI，室温避光反应15 min，加入400 μl 1×Annexin结合液，上流式细胞仪检测。

1.7 激活SHH信号通路对SGC-7901细胞凋亡的影响 用1 μmol/L的SHH特异性激活剂PM诱导si-FOXQ1组细胞24 h，记为si-FOXQ1+PM组，以si-FOXQ1组细胞为对照。Western blot检测细胞中Bax、Cleaved Caspase3、SHH、Smo、Gli1和Gli3蛋白相对表达水平，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

2 结果

2.1 FOXQ1 mRNA在胃癌细胞中表达 qRT-PCR检测永生化胃黏膜上皮细胞GES-1和不同胃癌细胞系中FOXQ1基因的表达，结果显示，GES-1、SGC-7901、MKN-28、GC-9811和AGS细胞中FOXQ1 mRNA相对表达水平分别为(1.00±0.11)、(3.16±0.33)、(2.27±0.26)、(1.92±0.21)、(2.44±0.25)。与GES-1细胞比，胃癌细胞SGC-7901、MKN-28、GC-9811和AGS中FOXQ1 mRNA表达水平显著升高(P<0.05)，并且胃癌SGC-7901细胞中的表达量最高，因此选择SGC-7901细胞作为后续实验研究对象。

2.2 转染FOXQ1 siRNA对SGC-7901细胞中FOXQ1基因表达的影响 转染si-FOXQ1、si-Control至SGC-7901细胞，qRT-PCR和Western blot检测结果显示，si-FOXQ1组SGC-7901细胞中FOXQ1 mRNA和蛋白表达显著低于si-Control组(P<0.05)。si-Control组和Normal组间FOXQ1 mRNA和蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图1,表1。

图1 SGC-7901细胞中FOXQ1蛋白表达条带

表1 SGC-7901细胞中FOXQ1mRNA和蛋白表达水平

2.3 转染FOXQ1 siRNA诱导SGC-7901细胞凋亡 采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率，Western blot检测Bax和Cleaved Caspase3蛋白表达水平，结果显示，与si-Control组比较，si-FOXQ1组SGC-7901细胞凋亡率、Bax和Cleaved Caspase3蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。si-Control组和Normal组细胞凋亡率及Bax和Cleaved Caspase3蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。见图2,表2。

图2 转染FOXQ1 siRNA对SGC-7901细胞凋亡的影响；A 流式细胞仪检测3组SGC-7901细胞凋亡；B Western blot检测3组SGC-7901细胞中Bax和Cleaved Caspase3蛋白表达情况

表2 SGC-7901细胞凋亡率及Bax和Cleaved Caspase3蛋白水平比较

2.4 激活SHH信号通路对胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响 使用SHH特异性激活剂PM处理转染si-FOXQ1的SGC-7901细胞24 h，结果显示，si-FOXQ1组比，si-FOXQ1+PM组SGC-7901细胞中SHH、Smo、Gli1和Gli3蛋白表达水平显著升高(t1=9.327，t2=4.287，t3=7.746，t4=6.971，P<0.05)；细胞凋亡率、Bax和Cleaved Caspase3蛋白表达显著降低(t1=6.000，t2=6.242，t3=10.651，P<0.05)。见表3,图3。

图3 激活SHH信号通路对胃癌细胞凋亡的影响;A 流式细胞仪检测细胞凋亡率；B Western blot检测细胞中蛋白表达

表3 2组SGC-7901细胞凋亡率及蛋白表达水平比较

2.5 转染FOXQ1 siRNA对SHH信号通路的影响 3组细胞转染48 h后，采用Western blot检测SHH信号通路关键蛋白及下游分子表达情况，结果显示，与si-Control组比较，si-FOXQ1组SGC-7901细胞中SHH、Smo、Gli1和Gli3蛋白表达水平均显著降低(P<0.05)。si-Control组与Normal组比较，SHH、Smo、Gli1和Gli3蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。见图4,表4。

图4 SHH、Smo、Gli1和Gli3蛋白表达条带

表4 3组SGC-7901细胞中SHH、Smo、Gli1和Gli3蛋白水平

3 讨论

FOXQ1是一种转录因子，作为致癌基因在癌症的发展和转移中起重要作用，日益收到研究者们的关注[11]。研究表明，FOXQ1在非小细胞肺癌、结直肠癌、乳腺癌、神经胶质瘤和肝细胞癌等癌症中表达升高，参与肿瘤的发生发展[12-14]。FOXQ1过表达通过促进膀胱癌和乳腺癌细胞的上皮间质转化活性来增强侵袭和转移，并且沉默FOXQ1可抑制膀胱癌和乳腺癌细胞的生长和转移[15,16]。Zhang等[17]研究显示，FOXQ1通过调控BCL11A/MDM2的表达诱导前列腺癌细胞的凋亡，并抑制其增殖。然而，FOXQ1对胃癌细胞凋亡的影响及其机制尚不清楚。本研究结果显示，FOXQ1在胃癌细胞系中的表达显著升高，提示FOXQ1基因可能在胃癌的发展中发挥致癌作用。沉默FOXQ1表达，SGC-7901细胞的凋亡率升高，提示抑制FOXQ1表达可诱导为癌细胞凋亡。邓大炜等[18]研究显示沉默FOXQ1表达可诱导肝癌SMMC-7721细胞凋亡，这与本研究结果一致。细胞凋亡是一种细胞程序性死亡过程，主要由Caspase介导，其中Caspase3是细胞凋亡的执行者，Caspase3激活形成Cleaved Caspase3可导致细胞发生不可逆的凋亡[19]。Bax是主要的细胞凋亡促进基因，其过度表达可使细胞趋于死亡[20]。本研究结果显示，沉默FOXQ1表达，SGC-7901细胞中Bax和Cleaved Caspase3蛋白表达显著上调，提示抑制FOXQ1的表达可能通过上调Bax和Cleaved Caspase3蛋白表达诱导胃癌SGC-7901细胞的凋亡。

SHH信号通路由SHH、Smo及下游转录因子Gli1和Gli3蛋白等组成，与肿瘤细胞的发生发展密切相关。研究显示，特异性阻断SHH信号通路能够有效抑制胃癌细胞增殖，并诱导其凋亡[21]。组蛋白甲基转移酶EZH2抑制SHH可体外诱导成神经管细胞瘤干细胞凋亡[22]。FOXQ1可通过调控SHH信号通路促进自然杀伤/T细胞淋巴瘤细胞的增殖和生长，且阻断SHH信号通路可诱导细胞凋亡[23]。但关于FOXQ1是否介导SHH信号通路影响胃癌细胞的生物学行为还未知。本研究结果显示，沉默FOXQ1表达后，SGC-7901细胞中SHH、Smo、Gli1和Gli3蛋白表达均显著下调，与文献报道结果[23]一致，提示胃癌SGC-7901细胞FOXQ1可能通过上调SHH信号通路及下游靶基因发挥作用。为验证该结论，本研究采用SHH信号通路特异性激活剂处理沉默FOXQ1后的SGC-7901细胞，结果显示，加入SHH信号通路特异性激活剂可部分逆转沉默FOXQ1对SGC-7901细胞凋亡促进作用，进一步说明FOXQ可能通过介导SHH信号通路诱导SGC-7901细胞凋亡。

综上，FOXQ1在胃癌细胞中呈高表达，沉默FOXQ1表达诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡，其作用机制可能与SHH信号通路有关。FOXQ1基因可能成为胃癌治疗的有效作用靶点，为胃癌的分子机制提供了新的见解，并为胃癌的治疗提供了新的理论基础。